- A+
推荐一篇发表在Journal of the American Chemical Society上的文章，标题为“Oxidation-Controlled, Strain-Promoted Tellurophene-Alkyne Cycloaddition (OSTAC): A Bioorthogonal Tellurophene-Dependent Conjugation Reaction”，通讯作者是多伦多大学化学系的Mark Nitz教授，他的研究方向主要为糖化学、微生物糖生物学以及生物分析化学。
之前的研究表明在水溶液体系中，卤素和过氧化物能够快速定量地将碲吩中的二价碲氧化为四价碲，使碲吩的芳香性降低，反应性提高。同时，包含碲吩结构的L-碲吩丙氨酸（TePhe）作为L-苯丙氨酸（Phe）的类似物，具有与苯丙氨酸高度相似的结构以及较低的毒性，使得细胞能够通过内源性机制有效地将其摄入细胞并掺入蛋白质中。本文中作者在此基础上开发出了一种基于碲吩的生物正交反应，称为氧化控制、张力促进的碲吩炔基环氧化反应（Oxidation-Controlled, Strain-Promoted Tellurophene-Alkyne Cycloaddition, OSTAC）：TePhe在N-氯琥珀酰亚胺（NCS）的氧化作用下，从Te（Ⅱ）被氧化为Te（Ⅳ），Te（Ⅳ）与桥环[6, 1, 0]壬炔（BCN）作用，可以发生张力促进的环加成反应。
图1. OSTAC反应示意图
作者首先用N-乙酰-L-碲吩丙氨酸-异丙酰胺作为TePhe在多肽链中的模型，验证了TePhe在水溶液体系中与NCS的反应性。通过引入N-甲基琥珀酰亚胺（NMM），并通过ESIMS与1H NMR对反应结果进行分析，作者证明了NCS氧化得到的Te（Ⅳ）物种自身之间以及与NMM之间均可以发生环加成反应，推测的反应历程如图所示。
图2. 推测的OSTAC反应历程示意图
接着，作者尝试用化合物1与BCN反应，实验证明在NCS的作用下，化合物1能够快速完全地与BCN进行环加成反应，得到苯并环辛烷产物。动力学研究表明动力学分析表明，微摩浓度的反应物能够在20分钟内反应完全，反应的速率常数为110 ± 10 M-1·s-1，反应决速步为环加成反应。该反应的动力学常数表明，Te（Ⅳ）与BCN的反应速率是Te（Ⅳ）自身二聚反应的5000倍。因此，OSTAC反应比大多数的SPAAC和SPANC反应都要快，与CuAAC的反应速率相当。
图3. 水溶液中验证TePhe与NCS的反应性
为了评估OSTAC反应的生物正交性，作者在三种具有不同二级结构和氨基酸组成的蛋白（MBP、Bcx、3CLpro）中引入了TePhe，接着用NCS和带有荧光素修饰的BCN探针（BCN-FAM）对蛋白进行标记，通过SDS-PAGE和ESI-MS证明OSTAC处理后BCN探针的标记能够选择性地发生在TePhe位点。但是在实验中作者发现NCS处理后会造成部分甲硫氨酸（Met）以及半胱氨酸（Cys）氧化，并且在对含有Cys的蛋白进行标记时，Cys会通过巯基-炔基反应以及磺酸基团的环加成反应使BCN发生非特异性标记。为了解决非特异性标记的问题，作者利用了DBCO与TePhe的低反应性，在BCN-FAM标记之前，先将蛋白与DBCO-OH以及NCS共孵育，并结合IAA的巯基烷基化处理，有效地消除了非特异性标记，并且这种阻断对于TePhe本身的反应并没有影响。
图4. OSTAC反应的生物正交性测试示意图
最后，作者尝试用OSTAC反应来标记细胞。作者首先测试了TePhe对细胞的毒性，结果表明TePhe在500 μM孵育6 h时对HEK293T细胞无毒，300 μM孵育24 h时仅显示出轻微的毒性。作者筛选出OSTAC反应标记细胞的条件为：400 μM TePhe处理细胞4 h，接着用150 μM DBCO−OH + 500 μM NCS封闭10 min，然后用2 μM BCN荧光团 + 100 μM NCS标记5−10 min。细胞实验结果表明，在固定的HEK293T细胞中，基于OSTAC的荧光标记强度依赖于TePhe的添加、NCS的氧化以及蛋白质合成过程，证明OSTAC反应可以用于细胞标记。
图5. OSTAC反应用于细胞标记
综上所述，本文中作者开发出了一种新型的基于碲吩的生物正交点击反应，该反应条件温和、反应速率较快，在使用DBCO阻断非特异性的Cys反应后可用于特异性标记蛋白质中的苯丙氨酸（Phe），为化学生物学家研究特定蛋白质提供了新的工具。
文章作者：LHC
原文链接：https://doi.org/10.1021/jacs.4c07275
责任编辑：WXL
目前评论：