为大家分享的是近期发表在Bioconjugate Chemistry上的一篇文章——Enhancing Cell Aggregation and Migration via Double-Click Cross-Linking with Azide-Modified Hyaluronic Acid。本文通讯作者为来自东京农工大学的Masayuki Tera。文章提出了一种方法，基于叠氮修饰的透明质酸，能够将细胞粘附在一起，形成性质稳定的细胞聚集体。

细胞间黏附不仅对维持组织的结构完整性至关重要，而且对促进细胞间的通讯也至关重要。通常，这种粘附过程是由钙粘蛋白家族中的蛋白质介导的，其协调细胞膜内外的结合。然而，对钙黏蛋白的依赖使得只有特定的细胞类型能够自发形成细胞聚集体。此外，细胞与细胞外基质（ECM）的相互作用对于细胞间的通讯至关重要——但由于其复杂性和缺乏直接的遗传编码，分析这些相互作用比较困难。基于上述复杂因素，有必要开发一种无需考虑细胞类型，直接进行细胞-细胞粘附的方法。

在作者之前的工作中，作者采用了点击化学的方法来实现——通过代谢Ac₄ManNAz在细胞表面引入叠氮，然后利用由水溶性环辛二炔(WS-CODY)介导的离子对增强串联SPAAC反应进行细胞-细胞粘附。尽管有一定的效果，但该方法需要通过强烈的离心来最大化细胞表面接触，且细胞渗透性阳离子WS-CODY有潜在的细胞毒性。

在本文中，作者对之前的方法进行了优化——使用了叠氮修饰的亲水聚合物作为连接剂——由于聚合物的高结构灵活性，可以实现有效的细胞粘附（图1）。在众多聚合物中，作者选择了透明质酸（HA）——HA具有很高的生物相容性，并且作为ECM成分在体内含量丰富，再加上由于成熟的发酵生产方法而获取方便；同时，HA中含羧酸的结构单元，有利于将叠氮修饰上去。此外，本文中采用的WS-CODY为硫代甜菜碱衍生物，具有生物惰性和稳定性。作者将该方法运用于人肺腺癌PC-9细胞，得到了预期的结果，并意外发现细胞迁移和粘附相关基因的表达改变。

图1 WS-CODY和HA-N₃促进细胞聚集形成的示意图

实验首先通过对比（图2）确定了最佳粘附条件：0.0025 w/v % HA-N₃, 100 μM WS-CODY，1500 G离心10 min（适当的离心能够在不破坏细胞的前提下提高SPAAC反应效率）。为了验证N₃修饰的细胞、HA-N₃、WS-CODY三者缺一不可，作者对不含叠氮的HA和细胞表面进行了实验（图3a）。此外，作者还用透明质酸酶（HAse）（50 U/ml, 37 ℃, 15分钟）处理最佳条件下形成的细胞聚集体——细胞聚集体分解（图3b），突出了HA-N₃在细胞聚集体形成中的关键作用。

图2 细胞聚集体形成条件的优化

图3 细胞聚集体形成的必要条件

然后，作者评估了细胞聚集体的维持能力——在6天长期培养后，聚集体几乎完全分散（图4a）。在这6天中，细胞聚集体表面积在48 h前增大，72 h后减小，这可能与细胞聚集体中细胞数量的增加或减少有关；细胞聚集体的圆度则在形成时最大，随着时间的推移逐渐降低。为了确定72 h后这些聚集体内活细胞和死细胞的活力和分布，作者对活细胞进行荧光素二乙酸酯(FDA)染色，对死细胞进行碘化丙啶(PI)染色(图4b)。结果显示，聚集体中心的细胞主要被PI染色。此外，作者还用Biotracker 520绿色缺氧染料处理细胞聚集体，发现整个细胞聚集体都是缺氧的——这可能是由于聚集体内部的增殖引起的。

进一步地，作者在对各阶段细胞聚集体使用含有HAase和5 mM EDTA（能够抑制Ca²⁺介导的细胞-细胞粘附）的PBS(-)处理后，进行了准确的细胞计数，其结果（图4c）与上文提及的细胞聚集体表面积变化一致。尽管从72 h开始，细胞数量逐渐下降，但细胞活力仍然保持强劲（图4d）。

图4 细胞聚集体的长期培养

作者推测了聚集体中细胞数量减少的原因：由于代谢引起的唾液酸周转和/或细胞分裂引起的细胞膜的重新分配，细胞表面交联的丧失可能导致聚集体的崩溃；另一个原因可能是，细胞增殖引起的聚集体内部压力导致透明质酸连接结构崩溃。为了评估交联结构维持细胞数量的能力，作者在培养48 h后将聚集体中的细胞数量初始设置为1.76 × 10⁵，并每24 h对聚集体内的细胞数量进行计数。结果（图5）表明，观察到的变化（细胞数量不减反增）可能主要不是由于交联结构的崩溃和随后由于增殖压力引起的细胞渗漏。

有趣的是，培养4天的细胞聚集体在聚集体周围出现弥散(图6a)，于是作者推测在细胞培养过程中可能发生了影响聚集体结构分散的遗传反应。为此，作者使用转录组分析（RNA-seq）来量化基因表达的变化。结果显示（图6b），编码透明质酸酶的基因HYAL1的表达增加了约6倍——其增加可能使得透明质酸酶分泌增强，导致透明质酸的降解，随后细胞从聚集体中逃逸。此外，结果还显示细胞间粘附分子1 (ICAM-1) mRNA水平增加了约23倍（ICAM-1是一种位于细胞表面的糖蛋白，作为整合素的配体，从而影响细胞迁移）；癌胚抗原相关细胞粘附分子5 (CEACAM5) mRNA水平也增加了约38倍；大鼠肉瘤同源家族成员B (RHOB)的mRNA水平下降了约7倍——这三者都对应了细胞迁移能力增强。

图5 交联结构维持细胞数量的能力

图6 分析96 h聚集体内细胞的生物学反应

总之，作者在原来的工作上，优化、进一步开发了一种方法：基于叠氮修饰的透明质酸，通过双点击化学偶联，能够得到性质稳定的细胞聚集体——所得聚集体在长达5天的时间内保持稳定，且存活率保持在80%左右。进一步研究表明，HA-N₃介导的细胞聚集会诱导基因表达的变化，特别是参与细胞迁移和细胞粘附的基因。该化学交联方法简单有效，可能在组织工程和再生医学中形成细胞聚集体和调节细胞-基质相互作用方面具有广泛的适用性。

文章作者：WAQ

原文引用：https://doi.org/10.1021/acs.bioconjchem.4c00221

责任编辑：WXL