α-氨基酯是一类非常重要的化合物，其结构独特，可用于合成非天然氨基酸。这类非天然氨基酸（ncAAs）在开发小分子药物、生物制剂以及化学生物学工具中扮演着至关重要的角色。然而，目前针对α-C-H键氨化反应的方法仍处于较为基础的发展阶段，特别是在如何通过氮烯转移实现这类酯类的直接氨化。传统的金属氮烯催化剂在处理带有电子吸引基团（例如羧酸酯）的C-H键时表现出较慢的氢原子抽提（HAA）速率，这主要是因为电负性金属氮烯优先与极性匹配的C-H键反应，而对于较为弱极性的质子性C-H键则反应不够理想。（图1B）鉴于此，研究人员将目光转向了一类新型的生物催化剂——氮烯转移酶。这类酶通过精确的分子识别和非共价相互作用，能够对底物的选择性结合和定位进行高度控制，从而提升反应的区域选择性和手性选择性。通过定向进化技术，有可能进一步优化这些酶的催化功能，使其在室温和温和条件下即可实现对羧酸酯的氨化反应，为α-氨基酯的生物催化合成开辟新途径。
图片来源：JACS
本研究开发了一种能够催化羧酸酯α-C-H键氨化反应的氮烯转移酶。（图1C）研究团队首先组装了两大类含血红素的蛋白库：一类是通过定向进化优化的P450氮烯转移酶，另一类是极端嗜热菌来源的小型血红素蛋白。这些蛋白在大肠杆菌中表达，并通过高通量筛选与氮烯前体和多种羧酸酯底物进行反应，筛选出表现出低活性的初始酶。随后，研究人员通过定向进化（DE）技术对初始酶进行优化，重点关注改进反应的产率与对映选择性。通过逐轮进化和突变筛选，他们最终获得了性能优异的L-ApPgb-αEsA-G11酶，能够在温和条件下催化α-C-H键的氨化反应，并显著提升了反应的对映选择性和产率。研究还利用高效色谱和质谱分析等方法，量化酶催化的氨化反应产物的产率和手性选择性，从而进一步优化酶的突变策略。
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本研究通过生物催化的手段，解决了长期以来羧酸酯α-C-H键氨化反应效率低的问题。L-ApPgb-αEsA-G11酶不仅展示了优异的手性选择性（对映选择性高达96%），还成功扩展了生物催化领域在合成氨基酯方面的底物范围，包括不同取代基的芳基羧酸酯、α,α-二取代的氨基酯以及潜在的药物中间体。此外，该研究中的定向进化策略展示了通过多轮突变和筛选，可以显著提升酶催化复杂化学反应的能力，突破了传统金属催化在此类反应中的瓶颈。除此之外，研究还首次实现了酶催化下D型α-氨基酯的合成，提供了一条新途径来开发抗药性肽中的非天然氨基酸，具有重要的药物开发潜力。这种新型氮烯转移酶不仅可以在常温和有氧环境下催化反应，也为将来进一步拓展生物催化范围打下了基础。
标题：Biocatalytic Synthesis of α-Amino Esters via Nitrene C–H Insertion
作者：EdwinAlfonzo,DeirdreHanley,Zi-QiLi,KathleenM.Sicinski,ShilongGao,andFrancesH.Arnold*
链接：https://doi.org/10.1021/jacs.4c09989
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