异常糖基化是许多疾病的标志，糖基化的检测具有重要的临床意义。基于凝集素/抗体识别的方法受限于普遍较低的糖结合蛋白亲和力导致的交叉反应性。在特定聚糖结构的检测方面，酶法标记具有其独特的优势，例如此前报道过过O-GlcNAc，LacNAc，α-GalNAc（Tn抗原），Fucα(1,2)Gal的酶法标记检测。修饰在N-聚糖核心五糖结构上的α-1,6岩藻糖，在细胞信号转导，B细胞发育，抗体依赖的细胞毒性和癌症发生中都发挥重要作用，FUT8催化L-Fuc以α-1,6的形式连接到N聚糖最内侧GlcNAc上。

对于潜在的高岩藻糖基化蛋白，如甲胎蛋白是FDA批准的肝细胞癌生物标志物，被广泛应用于早期癌症筛查，但在病毒性肝炎或肝硬化病例中AFP水平同样升高。有趣的是，其中仅肝细胞癌（HCC）病例中AFP岩藻糖基化水平升高，因此Fuc-AFP被认为是更具特异性的HCC生物标志物。此外，人类IgG1的岩藻糖基化修饰对其ADCC效率影响也很大。

图1 检测核心聚焦糖蛋白的化学酶标记策略

此前已有研究证明来自秀丽隐杆线虫的GALT-1能将UDP-Gal修饰到α-1,6Fuc上，作者猜测该酶也能容忍6-Az形式的UDP-Gal-6-N₃，进而偶联CuAAC或SPAAC反应。其中UDP-Gal-6-N3通过6-Gal-N3以GalK-AtUSP酶法串联催化得到。通过MALDI-TOF MS验证了GALT-1分别催化化合物2向化合物3或4的转化。

图2 化学酶法合成的N-聚糖结构，用于评估GALT-1受体底物特异性

作者进一步使用岩藻聚糖N6000和turn-on型UDP荧光探针对GALT-1的动力学特征进行描述，发现UDP-Gal-6-N3的Kcat/Km相比天然糖供体降低约3倍，因此认为GALT-1对UDP-Gal-6-N3仍保留较高的催化活性。

图3 用GALT-1和UDP-Gal-6-N3标记核心岩藻糖基化蛋白

接下来作者验证了GALT-1对不同岩藻糖基化聚糖的特异性，这些底物由酶法合成得到。这些岩藻N-聚糖都能被GALT-1标记，并且催化活性以N6000，N6001，N6002的顺序逐渐降低，值得注意的是当底物为α,1-3 Fuc连接或缺乏Fuc时GALT-1并无活性。岩藻糖基化在高尔基体分泌通路中完成，因此作者猜测如果能将GALT-1靶向表达到高尔基体，则能实现细胞内N-聚糖的标记。利用高尔基体靶向序列将GALT-1靶向表达到高尔基体，并在SMMC-7221细胞系进行了证明。具体操作为，在细胞内表达GALT-1 48 h后，收集N-糖肽进行MS组学分析，并用StrucGP软件进行分析。在总共3296个多肽谱匹配中共有670条岩藻糖基化多肽，其中511个Fuc位点修饰了Gal，修饰占比76.2%。对丰度靠前的岩藻聚糖进行分析，发现它们的结构与此前体外验证时的高活性底物结构类似，如五糖核心结构（90%），或仅有2个LacNAc延伸如N6000，N6001（84.1%）。

牛甲状腺球蛋白是一种已知的核心岩藻糖基化蛋白，作者将它与GALT-1和UDP-Gal-6-N3孵育并后续加入炔基-TAMRA，发现随时间推移胶内荧光信号增强。此外，也在HepG2肝癌细胞分泌蛋白中获得了稳定的标记结果。作者在多种细胞裂解液中进行化学酶法标记后的IP验证，发现几种典型的岩藻糖基化蛋白如AFP能被有效富集。此外，在FUT8基因未敲除的动物组织样本，且不使用PNGase F切除的GALT-1标记组才能产生明显的Click反应信号。

作者进一步在CHO-K1细胞系中使用GALT-1和UDP-Gal-6-N3标记岩藻糖基化蛋白，通过Click反应偶联炔基-生物素后，使用链霉亲和素beads进行富集，通过二甲基化氨基进行同位素衍生，以此进行MS组学定量，并鉴定到假定的413个核心岩藻糖基化蛋白，有60%左右的糖蛋白在3次重复中均出现。细胞定位分析发现绝大部分蛋白定位于内质网腔，细胞膜和线粒体，GOBP分析显示这些蛋白与小连接，细胞基质粘附等相关，GOCC分析进一步发现这些蛋白大多与细胞膜功能相关。

图4 免疫荧光成像和流式细胞术验证GALT-1标记CHO-K1细胞系效果

作者尝试标记活细胞表面的核心岩藻糖，在37 ℃标记2 h后加入DBCO-biotin和SA-AF488进行共聚焦成像，GALT-1(+)组得到阳性信号，而使用shRNA干扰FUT8表达则无法检测到AF488信号 。使用特定的糖苷酶进行切割验证，发现PNGase F会使信号极大降低，而α-1,2岩藻糖苷酶则影响不大，相对的，α-1,3/4岩藻糖苷酶则使信号极大降低。

作者尝试用GALT-1进行HCC早期诊断。来自健康/HCC血浆标本经过去白蛋白和抗体处理，或仅做去白蛋白处理。免疫印记显示在50 kDa左右有很强信号，提示为Ig重链，且在HCC病人样本中明显更高，这肯定了分析血浆糖蛋白岩藻糖基化对HCC诊断的价值。使用anti-IgG抗体包被的ELISA板捕获岩藻糖基化IgG，进而进行GALT-1标记，HRP显色，同时使用抗IgG抗体检测IgG总量。通过双尾t-检验发现HCC病人IgG岩藻糖基化程度更高。绘制ROC曲线并计算AUC值为0.827，表明其为不错的诊断标志物，并且能区分正常个体，肝炎患者和HCC患者。

图5 从临床血清样本中捕获和检测核心岩藻糖基化IgG

总的来说，本文报道了一种新型的GALT-1标记方法，在细胞内，细胞膜，细胞裂解液等体系中均能开展，并用于后续的组学验证和核心岩藻糖基化生物标志物检测。

本文作者：MY

原文引用：https://doi.org/10.1021/jacs.4c09303

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