分享一篇发表在Cell Chemical Biology上的文章Reducing CRISPR-Cas9 off-target effects by optically controlled chemical modifications of guide RNA。文章的通讯作者是来自武汉大学的田沺教授，主要的研究方向是核酸化学生物学。
CRISPR-Cas9基因组编辑技术是一种强大的工具，能够实现目标基因的调控。虽然这一技术能实现针对目标基因的高效编辑，但是同时也存在无法忽视的脱靶效应。在本文中，作者发展了一种基于RNA化学修饰以及光激活生物正交反应的针对sgRNA的修饰调控方法，实现了对细胞中CRISPR-Cas9基因编辑系统的光控终止以及脱靶效应的有效控制。作者主要通过生物正交反应对sgRNA的结构和功能进行调节，从而实现对编辑系统活性的调节。他们使用了较为成熟的RNA 2’-OH的修饰技术，在sgRNA上先衍生带有乙烯基醚（VE）的基团；VE可以在可见光催化下同9,10-苯萡醌（PQ）进行反应，在sgRNA上引入更大的化学基团并对sgRNA的结构产生破坏，从而调节后续的基因编辑过程。作者首先在体外实验中证明了VE能够顺利修饰在21nt或23nt的短链RNA上，410nm光催化下VE能够继续和PQ发生反应。VE基团的引入不会明显影响RNA的配对能力、二级结构以及与小分子配体发生相互作用的能力，而在光催化下和PQ发生反应后，RNA的结构和功能就会受到明显影响，说明VE和PQ的引入可以实现对RNA结构和功能的精确调节。接下来，作者测试了通过这种RNA调节方法对CRISPR-Cas9切割活性的调节能力。在30分钟内，VE对sgRNA的修饰不会明显影响Cas9的切割活性，而在光照和添加PQ的条件下，Cas9的活性迅速下降；在类似的CRISPR-Cas13a系统中，VE和PQ也能高效地调节蛋白活性。在活细胞中，作者在多个基因上证明了这种基于RNA的调节方式能够成功终止细胞的基因编辑过程，同时在CRISPRi以及CRISPRa系统上也有效果，说明这是一种可拓展的生物正交的调节方法。最后，作者检测了这一调节方法对基因编辑的脱靶效应的影响。在操作上，首先使用VE修饰的sgRNA进行有效的基因编辑，之后通过外加PQ和光照使得sgRNA的结构被迅速破坏以终止反应，最后取终止后48h的样品进行GUIDE-seq来评估基因编辑的脱靶技术。在使用这一调控后，基因编辑的脱靶效应比例从61.4%下降到4.3%，并且比小分子抑制剂等调控手段更为有效。总之，本文发展了一种基于光控生物正交剪切反应的sgRNA调控方式，能够实现CRISPR-Cas9基因编辑功能的精准关闭，从而降低脱靶效应。https://www.cell.com/cell-chemical-biology/fulltext/S2451-9456(24)00402-1原文引用：https://doi.org/10.1016/j.chembiol.2024.09.006
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