唾液酸 (Neu5Ac) 是一种九碳α-酮酸单糖。唾液酸转移酶 (ST) 将胞苷单磷酸-Neu5Ac (CMP-β-D-Neu5Ac) 的Neu5Ac安装到哺乳动物细胞的糖缀合物上。探测单个ST家族成员的化学工具受到科学家们的关注，而具有细胞活性的ST抑制剂是基于3F_axNeu5Ac (3) 支架的分子，它在细胞内代谢转化为CMP-3F_axNeu5Ac (5)。氟的轴向性很关键，但在这特定方向安装氟是有挑战的。

化学合成法存在步骤多、收率低，需通过色谱纯化来分离3F_ax和3F_eq异构体等缺陷。由醛缩酶介导的化学酶法也存在反应可逆、受热力控制、需色谱纯化异构体等不足。于是，作者提出通过联用唾液酸醛缩酶与CMP-唾液酸合成酶来捕获3F_ax的动力学产物，并以60%的收率获得了CMP-3F_axNeu5Ac(Scheme 1)。

Scheme 1. 动力学捕获CMP-3F_axNeu5Ac

化合物5在酸性条件下不能直接转化成3，而是先生成7 (3F_ax-Neu5Ac-2P)，然后经碱性磷酸酶 (ALP)催化获得目标产物。为了量化F缓解5水解的程度，作者进行了基于MS 的动力学分析，分别将2和5水解成1和7，结果发现C3位置的F取代使水解速率降低了约100倍（图1）。

图1. 通过中间体7将 CMP-3F_axNeu5Ac (5)转换为3F_axNeu5Ac (3)

随后，作者在U937细胞测试3a，发现它能有效降低Siglec-1, -2, -3, -5, -7, -8和-15的唾液酸聚糖配体水平（图2）。

图2. 3F_axNeu5Ac降低细胞内Siglec配体水平

接下来，作者检验动力学捕获方法能否有效获得5的衍生物。如Scheme 2所示，作者通过级联酶法顺利获得兼具光交联基团和点击手柄的双官能衍生物。相比之前的合成方法，该新型化学酶法，步骤少、产率高。

Scheme 2. CMP-9-N-DAz-3F_axNeu5Al (11) 的合成

接下来，作者将光交联探针11与三种人源重组的ST：ST6GAL1, ST3GAL1和ST3GAL4进行UV交联测试。首先，作者使用11与三种高浓度 (500 μM) 的ST进行测试，观察到11对ST6GAL1产生强的UV依赖性光交联，对ST3GAL4有最弱的UV依赖性光交联，且与ST3GAL1无光交联。随后，降低11的浓度，发现11对ST3GAL1有明显的选择性，甚至只需10 μM 11可实现与两者的光交联。当增加CMP-Neu5Ac (2) 的浓度时，11对ST6GAL1活性位点的特异性会被竞争性抑制（图3）。

图3. ST6GAL1与11的选择性光交联

最后，作者评估了化合物11和5对ST6GAL1, ST3GAL1和ST3GAL4的抑制强度和亲和力。结果表明，与5相比，11对ST6GAL1的抑制力稍有增加；对ST3GAL4有相似的抑制强度；对ST3GAL1缺乏抑制效力。另一面，11与ST3GAL1的结合较差，与ST6GAL1, ST3GAL4有相似的结合强度（图4）。

图4. 5和11对三个ST的亲和力和抑制力测量

总之，作者报告了一种快速、精准合成ST探针 (CMP-3F_axNeu5Ac) 的动力学方法，并且验证了该方法可用于获得C5, C9位置改造的探针，及其能实现不同ST间的选择性交联。

文章作者：YX

原文链接：https://pubs.acs.org/doi/10.1021/jacs.4c10835

责任编辑：WXL