分享一篇近期发表在J. Am. Chem. Soc.上的研究进展，题为： Selective pH-Responsive Conjugation between a Pair of De Novo Discovered Peptides。该工作的通讯作者是来自东京大学的Yuto Ohno。 在生物化学领域，实现肽和蛋白质的选择性修饰是一项至关重要的技术。传统的蛋白质修饰方法虽然能够制备出均一的蛋白质-小分子偶联物，但这些方法通常是不可逆的。相比之下，现有的可逆蛋白质标记技术往往不具备位点选择性。本文作者开发了一种全新的策略，发现了一对能够选择性反应的肽，它们在中性条件下（pH 7.5）形成稳定的偶联物，但在碱性条件下（pH 10.0）迅速解离（图1）。图1. 本文研究示意图，ITC6与CP1的选择性反应 异硫氰酸酯通常用作蛋白质标记试剂：异硫氰酸荧光素（FITC）可能是最常用的荧光团之一，它主要与蛋白质赖氨酸残基反应形成稳定的硫脲键。该反应通常不具有选择性并且需要较高的pH值加速。异硫氰酸酯和硫醇反应更快，但是反应可逆，通常不会形成稳定的偶联物（图2）。基于此，作者假设含半胱氨酸的肽与含异硫氰酸酯的探针之间的可逆反应可以作为相互选择性、刺激响应性化学的基础。 为了发现能够形成稳定偶联物的肽序列，作者使用了mRNA显示的一种变体RaPID（随机非标准多肽整合发现），这是一个能够生成和筛选大的（>1012序列）遗传编码肽文库的发现平台，通常用于识别所选蛋白质的高亲和力肽配体。 作者设计了一个两阶段的发现过程。作者首先通过与小分子异硫氰酸酯的反应筛选含有Cys的多肽分子，再通过与第一步筛选得到的含Cys多肽分子的反应，筛选含有异硫氰酸酯的多肽分子。 作者设计了一个编码含半胱氨酸环肽的mRNA库，并通过与含生物素的异硫氰酸酯ITC1的反应进行筛选（图3）。经过六轮筛选，通过测序分析确定了几个富含半胱氨酸的序列家族。进一步合成和表征后，发现CP1与ITC1形成的偶联物最为稳定，因此被选为后续研究的对象。 接下来，作者设计了一个编码含异硫氰酸酯环肽的mRNA库，并与生物素化的CP1进行反应筛选（图4）。经过七轮筛选，通过测序分析，确定了几个富含异硫氰酸酯的序列。进一步合成和表征后，发现ITC6与CP1形成的偶联物具有最高的动力学稳定性，因此被选为后续研究的对象。 接着作者详细表征了ITC6与CP1的反应（图5）。作者通过与CP8和ITC8的交叉反应验证，证明了CP1与ITC6反应更加迅速，形成的偶联物DTC1.6在中性条件下更稳定。作者后续通过液相色谱-质谱联用（LC/MS）和核磁共振（NMR）光谱分析，确证了DTC1.6的结构。 随后作者研究了DTC1.6中二硫代氨基甲酸酯键稳定结构的决定因素（图6）。作者首先将两者的序列打乱以及环打开，发现序列和环状结构的影响对于CP1更大。作者后续改变了异硫氰酸酯的结构，发现CP1与小分子异硫氰酸酯的反应性较差。作者通过丙氨酸扫描突变研究，发现CP1中的6RDCXXXXP14W基序和CP1与ITC6之间的静电相互作用对偶联物的稳定性至关重要。此外，盐浓度也显著影响偶联物的稳定性，相比于DTC1.1，通过静电稳定的DTC1.6随着氯化钠浓度增加，半衰期迅速下降。 最后作者展示了DTC1.6的pH响应性解离及其在生物化学中的应用（图7）。研究发现，DTC1.6在pH为7.5时半衰期为347 min，而在pH为10时，半衰期降低至5 min。这一特性使得ITC6可以作为拉下试剂从含巯基的复杂生物样品中选择性分离CP1，同时也可作为临时保护基团保护CP1免受非特异性半胱氨酸标记试剂的影响。 综上，本文开发了一对能够选择性反应的环肽，它们具有中性pH下相互的专一偶联选择性以及高pH下解离能力。这一化学体系有望在更多领域展现出其独特的优势和广泛的应用前景。DOI: 10.1021/jacs.4c08520Link: https://doi.org/10.1021/jacs.4c08520
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