分享一篇发表在Analytical Chemistry上的文章，题目为Online, Bottom-up Characterization of Histone H4 4–17 Isomers。本文通讯作者为华盛顿大学的Benjamin A. Garcia教授以及佛罗里达国际大学的Francisco Fernandez-Lima教授。Garcia课题组主要基于质谱进行蛋白质翻译后修饰的组学鉴定，Fernandez-Lima课题组则致力于发展质谱技术并拓展至丰富的应用场景。
组蛋白密码由特定类型和位置的翻译后修饰（PTMs）组成，可产生基因调控的生物信号，并有可能成为医学诊断的生物标志物。以往的研究表明，电子碎片技术可提高序列覆盖率和易变 PTM 位置分配的可信度。在这里，作者评估了两种衍生化方法（如不可逆-丙酰化和可逆-柠檬酰化），利用在线液相色谱法（LC）、捕集离子淌度（TIMS）和电子解离法（ExD）串联质谱法对组蛋白 H4 4-17进行自下而上的分析。作者使用了两个平台：基于布鲁克Impact的定制LC-TIMS-q-ExD-ToF MS/MS和商用μLC-EAD-ToF MS/MS SCIEX仪器。
与丙酰化类似物相比，内源性乙酰化异构体的H4 4-17（0-4ac）蛋白水解肽的IMS分离效果更好。例如，H4 4-17 1ac内源异构体在LC中保留时间相同，但在[M+3H]3+离子形式中被TIMS分离。两种（K5acK16和K8acK12ac）和三种（K5acK8ac、K5acK12ac 和 K8acK16ac）H4 4-17 2ac内源异构体在LC中留时间相同，但它们在[M+3H]3+离子形式中的迁移率是分离的。三种 H4 4-17 3ac内源异构体（K5acK8acK16ac、K5acK12acK16ac 和 K8acK12acK16ac）在LC中共流出，但在 [M+3H]3+离子形式中则基线迁移率分离；K5acK8acK12ac在LC和迁移率域中与其他异构体分离。无论离子形式如何，丙酰化肽在异构体之间的 LC 和迁移率域重叠度都较高。在线LC-ExD-MS/MS为两种仪器平台中的所有 H4 4-17 (0-4ac) 蛋白形式提供了较高的序列覆盖率（大于 90%）。
当应用于组蛋白去乙酰化酶抑制剂处理的HeLa时，两种衍生方法和平台都能根据H4 4-17 (0-4ac)蛋白水解肽的特征碎片离子实现准确鉴定。通过进行 LC-ExD分析，作者确定了 8 种不同的蛋白形式（可能有 16 种），而使用 μLC-EAD 方法只能确定 5 种。允许质量选择的 LC-q-ExD 平台配置大大提高了信噪比（S/N），提高了更多肽段报告离子的可见度，两种方法检测到的肽段平均序列覆盖率相当（μLC-EAD 和 LC-ExD 的平均序列覆盖率分别为 35% 和 32%）。对柠檬酰化（内源性）的H4 4-17 进行的 LC-q-ExD 分析可鉴定出 11 种不同的蛋白形式（10 种来自报告离子），平均序列覆盖率为 35%。
综上所述，本文验证证明了在线互补液相色谱、TIMS 和 ExD MS/MS 的进步，为使用可逆和不可逆衍生方法进行更全面的组蛋白蛋白形式分析铺平了道路。
本文作者：TZS
责任编辑：ZF
原文链接：https://pubs.acs.org/doi/10.1021/acs.analchem.4c02549
原文DOI：10.1021/acs.analchem.4c02549
目前评论：