分享一篇发表在JACS上的文章，文章的题目是“Selective pH-Responsive Conjugation between a Pair of De Novo Discovered Peptides”，通讯作者为东京大学的Hiroaki Suga教授教授以及Alexander A. Vinogradov副教授。Hiroaki Suga教授同时也是2023年的沃尔夫化学奖得主。主要研究方向是人工核酶，遗传密码重编程以及非标准肽等领域。
肽和蛋白的位点选择性修饰是生物偶联化学中的一项关键技术，可以在具有多种相似化学反应性基团的复杂生物背景下，特异性地对靶标蛋白/肽中的特定氨基酸残基实现位点选择性的标记。生物偶联化学在诸如抗体偶联药物，PET探针，以及生物大分子荧光报告标记等场景都有着十分重要的应用价值。在该策略中，对蛋白反应特异性以及氨基酸区域选择性通常通过序列标签实现，在特异性结合后，再通过反应性标记探针与蛋白偶联。理论上，对序列标签和反应性探针的同时优化可以提供最高的相互作用选择性和反应速率，但是在实践中，该方法尚未被充分探索。除此之外，目前大多数位点选择性标记化学均为不可逆共价反应，相比之下，可逆肽/蛋白标记的研究则相对较少。针对上述问题，本文通过mRNA展示技术从头发现了一对非标准肽，二者可以pH响应性的实现选择性可逆偶联。这里作者首先对反应性探针进行了选择与设计。异硫氰酸酯是常用的蛋白标记试剂，生物环境下稳定，且已知具有和CYS的反应活性。且异硫氰酸酯和CYS的反应具有良好的反应速率，生成的二硫氨基甲酸酯也能做到完全可逆，可重新解离成具有反应性的异硫氰酸酯，从而实现探针的再生。因此作者选择使用异硫氰酸酯作为CYS反应性探针。随后，作者采用了一种称为随机非标准肽集成发现（RaPID）的策略进行序列标签的筛选。该方法是一种能够生成和筛选大型基因编码肽库的序列发现平台，通常用于识别与发现和目标蛋白具有高亲和力的肽配体。同时该技术也非常适合遗传密码重编程，从而在肽配体中掺入具有反应性的非天然氨基酸，例如对异硫氰酸酯苯丙氨酸pNCS。为了开发所需的含有CYS和pNCS的肽对，作者设计了一个二阶段筛选发现过程。第一次筛选中，先筛选与异硫氰酸酯分子具有反应性的含CYS肽，随后的第二次筛选中，针对第一次筛选到的含CYS肽筛选与其具有反应性的含pNCS肽。通过该二次筛选策略，最终发现了一对能够相互反应并形成复合物DTC1.6的肽对CP1和ITC6，二者可以实现k1= 340±20 M-1s-1的反应速率常数，具有非常快的反应动力学。接下来作者测量了复合物DTC1.6在不同pH下的半衰期。结果发现，在高pH环境下，DTC1.6会发生更快的解离，半衰期将从生理条件的pH=7.5时的347±7min变为pH=10下的5±2min。解离速率加快近70倍。这种快速的pH响应性解离使该反应的可逆控制变得非常便利，尤其是在需要高度选择性和可逆性的应用场景中将具有非常大的潜力。最后基于上述发现，作者在CYS可逆保护和复杂生物样品中选择性pull down的实验中验证了上述策略的应用前景。首先在CYS可逆保护中，作者将CP1和其线性类似物CP1lin混合，在中性pH下与ITC6孵育，随后用IAA对暴露的CYS进行乙基化。结果发现在pH=7.5下，CP1lin的CYS发生了乙基化，而CP1则依然和ITC6保持DTC1.6复合物的形态。当pH提高到10时，再向其中添加Biotin-S-Spy，发现CP1的CYS成功被Biotin标记，说明该反应的选择性和可逆性，并表明ITC6可以作为一种稳健的CP1的CYS保护基，并通过pH控制保护基的安装与移除。此外作者也尝试在复杂生物样品中使用ITC6对CP1进行pull down。此处作者首先对HEK293H细胞进行裂解，由于该裂解液中存在大量巯基，因此可以很好的用于鉴定ITC6对CP1的选择性。随后在该裂解液中加入CP1，而后用Biotin-ITC6对该混合物进行孵育，并用Streptavidin进行pull down。结果表明Biotin-ITC6可有效pull downCP1，回收率为23%。综合以上结果表明，CP1和ITC6可以在外源巯基存在的情况下依旧高选择性的反应，同时碱性条件可以对该反应实现高效的逆转。总而言之，本文中作者通过RaPID策略从头发现了一对非标准肽CP1和ITC6，二者可以pH响应性的实现高选择性可逆偶联。这一方法补充了现有肽和蛋白可逆修饰方法的空缺，适用于多种需要选择性可逆反应的化学生物学场景。
本文作者：QJL
责任编辑：ZJ
原文链接：https://pubs.acs.org/doi/10.1021/jacs.4c08520文章引用：DOI：10.1021/jacs.4c08520
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