近期发表在Nature Communications上的一篇文章，题目为："Chemistry-driven translocation of glycosylated proteins in mice"。文章的通讯作者是东京工业大学材料与化学技术学院化学科学与工程系Katsunori Tanaka和Tsung-Che Chang。在本文中，作者基于生物正交点击释放（click-to-release）反应开发了一种聚糖模式重塑策略，实现了糖白蛋白从初始靶标转移到第二个靶标。

细胞表面的糖蛋白、糖脂和蛋白聚糖在细胞间识别中起着重要作用。单个糖基和相应凝集素之间的相互作用相对较弱，而在细胞表面形成的聚糖簇通过多价效应实现了高亲和力相互作用（图1a）。不同类型的天然聚糖分子形成不同的簇，从而产生不同的“聚糖模式”（“glycan patterns”）（图1b）。这些聚糖模式强化了细胞识别的选择性（即聚糖模式识别），在生物过程中起着重要作用。作者的小组在之前的工作中利用自己开发的RIKEN点击反应可以各种N-聚糖连接在人血清白蛋白上，合成具有不同聚糖模式的糖白蛋白（图1c）。此前的结果表明，白蛋白上聚糖模式的微小变化会显著改变细胞的靶向选择性和体内生物分布。此外，体内动力学和解剖分析表明，这些糖清蛋白的动力学在很大程度上取决于小鼠的聚糖模式识别。如图1c-ii所示，与分布在全身的未修饰白蛋白相比，在白蛋白上引入10个α（2,3）-唾液酸化N-聚糖可以提高其在血液中的稳定性并且延长血液循环驻留时间。同时还发现α（2,3）-唾液酸化糖蛋白显示出优先的尿液排泄，而半乳糖基化糖白蛋白则会易位到肠道排泄。基于这些结果，作者假设在体内转化和重塑糖白蛋白的聚糖模式可能会实现糖白蛋白从一个靶标转移到另一个靶标（图2a）。

为了在体内有效地实现聚糖模式的重塑，作者重点研究了Robillard等人报道的点击释放反应。在这个反应中，反式环辛烯（TCO）和四嗪（Tz）之间的逆电子需求Diels-Alder反应（IEDDA）之后，TCO基团释放出有效载荷分子。基于此点击释放机制，可以通过将TCO衍生物与白蛋白结合，并通过自焚氨基甲酸酯基团与α（2,3）-唾液酸化N-聚糖进行连接（图2c）。在与带有Tz的半乳糖基化N-聚糖进行IEDDA后，通过从 TCO 部分释放 α（2,3）-唾液酸化聚糖可以将白蛋白上的聚糖模式重塑为半乳糖基化模式。预测在体内进行该生物正交点击释放反应会导致糖白蛋白从血液或 SW620 肿瘤转移到肝脏从而导致肠道排泄（图2b）。

基于假设，作者首先设计合成了包含TCO的不饱和醛探针1。利用SPAAC点击反应将探针1与α（2,3）-唾液酸化聚糖2进行偶联得到了聚糖醛9。同时，由化合物11与半乳糖基化10反应的到了半乳糖糖基Tz（Gal-Tz）。（详细合成路线见图3）。

合成完成后，作者首先在体外检测了重塑聚糖模式的可行性。作者使用小组先前报道的RIKEN 点击反应生成了糖白蛋白-I（glycoalbumin-I）。接着作者使用过量的Gal-Tz和糖白蛋白-I（glycoalbumin-I）反应，通过MALDI-TOF-MS实时检测糖蛋白的分子量来评估 α（2,3）-唾液酸化聚糖被半乳糖化聚糖取代的过程（图4）。糖白蛋白-I（glycoalbumin-I）的分子量在5-10 分钟内迅速增加到128 kDa，最终在16 小时后达到110 kDa，表明糖白蛋白-I（glycoalbumin-I）释放了 6 个 α（2,3）-唾液酸化聚糖分子，得到了“重塑”的糖白蛋白II （glycoalbumin-II），其聚糖模式变为 6个α（2,3） -唾液酸化聚糖和 10 个半乳糖基化聚糖组成。因此，在体外验证了改变化学合成的白蛋白“聚糖模式重塑”是可行的。

接着，作者研究了白蛋白的聚糖模式重塑是否会改变细胞结合的选择性。作者选用HepG2作为靶细胞，将其与TAMRA 标记的糖白蛋白-I 和-II 在 37 °C 下孵育 3 小时用 PBS 洗涤以去除非特异性结合的糖白蛋白后，进行细胞荧光成像。糖白蛋白-II 上的半乳糖基化模式比糖白蛋白-I 上的唾液酸化模式显示出与 HepG2 细胞更强的相互作用。此外，在相同的孵育条件下，将TAMRA标记的糖白蛋白-I 和Gal-Tz共处理HepG2细胞，TAMRA荧光显示的强度与仅TAMRA标记的糖白蛋白-II 的处理相似。这些结果表明，通过点击释放反应将糖白蛋白-I 上的 α（2,3） -唾液酸化聚糖模式重塑为半乳糖基化聚糖模式，会导致其与 HepG2 细胞的结合增加（图5）。

因为α（2,3）-唾液酸化糖白蛋白与人结肠癌 SW620 细胞具有很强的结合作用，作者想利用“体内聚糖策略重塑”来减弱糖白蛋白-I 与SW620细胞的相互作用，从而检测这是否会导致糖白蛋白-I 最终移向肠道。因此，作者接下来进行了体外SW620细胞的实验。TAMRA 标记的糖白蛋白-I 和 -II 清楚地表明，糖白蛋白-I 上的 α（2,3）-唾液酸化模式比糖白蛋白-II 上的半乳糖基化聚糖模式表现出与 SW620 细胞更强的相互作用。通过 Gal-Tz 共处理后，TAMRA 标记的糖白蛋白-I 与 SW620 细胞的相互作用显著减少。这些结果表明通过使用聚糖模式重塑将糖白蛋白-I 从 SW620 肿瘤易位到肠道是可行的（图6）。

接下来，作者进行了动物实验来研究“体内聚糖模式重塑”。用近红外荧光团 HiLyte Fluor 750^® 标记糖白蛋白-I 和 -II，通过分子成像分析体内动力学和器官特异性易位。将三组小鼠通过静脉注射接受指定的糖白蛋白 （糖白蛋白-I 、糖白蛋白-I 与 Gal-Tz 的共同注射和糖白蛋白-II），3 h后，解剖小鼠，测量整个腹腔和收集的肠道、血液和尿液的荧光强度（ROI）得到的结果（图7）。用糖白蛋白-I 处理的小鼠在肠道中显示出微弱的荧光信号，而用糖白蛋白-II 处理的小鼠在肠道中显示出明显的荧光活性以及在共同注射糖白蛋白-I 和 Gal-Tz 的组中发现肠道中的荧光活性与对照糖白蛋白-II 组相似（图7）。这些结果表明，通过点击释放反应使糖白蛋白-I 上的 α（2,3）-唾液酸化聚糖模式重塑为半乳糖基化聚糖模式，导致了其肠道易位。

有了前面动物实验的结果，作者利用相同的策略继续研究了在小鼠 SW620 癌症模型中的糖白蛋白-I 从肿瘤细胞到肠道的易位。由于 α（2,3）-唾液酸化聚糖模式对 SW620 肿瘤具有高亲和力，因此将糖白蛋白-I 直接瘤内注射到癌症区域会显示出在肿瘤部位显著的积累。相比之下，共注射糖白蛋白-I 和 Gal-Tz 的组在肠道中显示出荧光活性，与接受糖白蛋白-II 的组相似。这些结果表明，基于化学反应的聚糖重塑策略在小鼠中成功诱导了从 α（2,3）-唾液酸化聚糖模式重塑为半乳糖基化聚糖模式，实现糖白蛋白易位（图8）。

总之，在本文中作者开发了一种独特的糖白蛋白，可以通过生物正交点击释放反应在体内发生其聚糖模式的转化和重塑，从而实现其从初始靶标转移到第二个靶标。这种“体内聚糖模式重塑”策略可以用作一种创新的药物递送系统，以促进治疗后药物或放射性核素药物从肿瘤中排出，从而防止长时间暴露而导致的不良反应。同时该策略也为使用单一糖白蛋白同时治疗多种疾病提供了新想法。