生物素标记 > 前沿动态 > Mol. Cell | PARPs实现胞内蛋白非依赖型多聚ADP-核糖的合成
推荐一篇发表在Molecular Cell PARP enzyme de novo synthesis of protein-free poly(ADP-ribose) ”。本文通讯作者是来自蒙特利尔大学生物化学与分子医学系的John M. Pascal 教授，其课题组致力于通过结构生物学和生化研究策略，实现DNA 损伤修复与PARPs 家族功能的分子机制解析。本文中，作者将经典生化策略和小分子质谱平台相结合，揭示了细胞中的蛋白非依赖型多聚ADP- 核糖的合成方式。
PARPs 家族成员将NAD 中的ADP- 核糖共价修饰到底物蛋白上，以此来招募蛋白复合物，实现生物学功能的调控。以其中最为经典的蛋白PARP1 为例，其能够通过快速激活多聚ADP- 核糖基化修饰（PAR ），响应DNA 损伤信号，实现有效的DNA 损伤修复，以维持细胞稳态。然而，此过程中不可避免的出现大量游离的PAR ，而过量积累的PAR 同样可以作为细胞程序性死亡的诱导剂，介导不依赖于Caspase 的Parthanatos 的发生。此前的研究中，研究者并未能够对此类PAR 的来源进行有效的解析。因此，本文中作者试图对此过程进行探索。 研究者首先在体外实验中，测试了游离PAR的存在与产生机制。通过使用三氯乙酸（TCA）对蛋白和代谢物进行严格的分离，他们发现，在可溶性上清中存在大量游离的PAR。通过质谱对其分子量进行分析，他们意识到，相比于连上蛋白后被水解脱落下来的PAR，可溶性上清中存在着大量保留了烟酰胺 结构的PAR。此外，即使在很低的NAD浓度下，游离的PAR依然可以被催化生成。基于X射线晶体衍射 的结果，他们确定了PARP1催化结构域（ART）与NAD类似物的结合情况。由此说明，此类PAR可以由PARP1的催化结构域或者全长PARP1蛋白直接产生。 随后，他们在体外实验中引入了PARP1的调节因子HPF1后发现，修饰在蛋白上的PAR水平显著升高，游离PAR的水平虽然有所降低，但是依然稳定在一个可以被有效检测到的水平。同时，使用诱导剂引发DNA损伤后，游离PAR的水平也同共价修饰在蛋白上的PAR一般，显著升高。这意味着，游离的PAR能够在生理情况下产生，并与DNA损伤修复机制密切相关。 最后，他们也对PAR的来源进行了进一步的确认。传统观点认为，PAR来源于蛋白上共价修饰的PAR的水解。而在本文中，一方面，通过检测，他们意识到水解下来的PAR并不能与实际游离的PAR的质谱表现一致。另一方面，在基于CRISPR/Cas9敲除策略的帮助之下，他们将能够把PAR从蛋白上水解下来的酶进行分别敲除后发现，这并不能显著影响游离PAR的水平。由此可知，PAR确实是由PARP1等酶直接产生的大分子代谢物。 综上，本文中作者通过经典生化技术和分析化学策略，成功揭示了细胞内源蛋白非依赖型游离PAR的来源，为游离PAR及其Parthanatos相关生物学过程提供了理论和技术支持。 https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S1097276524008645 原文引用：DOI： 10.1016/j.molcel.2024.10.024
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