推荐一篇发表在Chem上的文章“De novo luciferases enable multiplexed bioluminescence imaging”，文章通讯作者是来自加州大学圣克鲁斯分校的Hsien-Wei Yeh教授，Yeh教授主要从事蛋白从头设计方向的研究。
基于生物发光技术在生物学成像等领域有着广泛的应用，荧光素酶由于其化学发光的特性，不需要外部光源，成像背景较低灵敏度较高。与荧光蛋白相比更适合于在宏观尺度成像。然而，目前已有的荧光素酶的种类较少，底物特异性较差，无法满足多通道成像的要求。而定向进化等策略由于自然界内存在的荧光素酶过少，不能很好地用于荧光素酶的开发。在此前的工作中本文作者使用family-wide hallucination的蛋白设计方法，得到了第一种从头设计的荧光素酶LuxSit。由于该工作中计算结果和实验结果的高度一致性，作者提出假设，荧光素酶的活性与底物结合口袋的几何形状以及关键的底物-酶相互作用有密切关系。本文中作者将荧光素酶底物DTZ结合口袋附近的氨基酸序列固定，利用ProteinMPNN算法生成其余氨基酸序列，成功得到了10000种新氨基酸序列，利用Alphafold2预测其结构，确保新设计的序列与LuxSit有相同的折叠和口袋几何形状。作者从中筛选了191个序列进行表达，测定其荧光素酶活性，发现191个序列中有134个具有荧光素酶活性，表明其假设正确。随后，作者大量表达了活性在前20的荧光素酶并对其进行进一步测试，20个蛋白均表达成功，其中发现有两个氨基酸序列其活性比LuxSit高10倍以上，其中一种显示出了单分散特性，作者将其命名为neoLux。作者通过进一步优化结构引入V83L突变得到了具有更高荧光素酶活性的neoLux1.2。该新型荧光素酶具有高活性，小尺寸，不需要辅因子的优点，更适用于生物成像。随后，作者希望将荧光素与FRET结合，从而实现生物体内的多通道成像。为了获得高FRET效率的融合蛋白，他们逐个删除neoLux的N端残基直到某一个结构域的结构遭到破坏，尽可能地缩短FRET供体和受体之间的空间距离。经过测试，他们找到了5对荧光素酶-荧光蛋白的FRET对，luxneon、luxGold、luxKOk、luxOFP和luxkate。这些FRET对与已有的FRET工具相比具有更高的发光效率。利用这些FRET对作者成功实现了在老鼠模型中的肿瘤多通道成像。综上，本文中作者通过从头设计的方法开发了新一代高活性荧光素酶，并利用FRET成功实现了生物体内的多通道成像。原文链接： https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S2451929424005394文章引用：10.1016/j.chempr.2024.10.013
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