推荐一篇发表在Nature Biotechnology上的文章，题目为“Directed evolution of engineered virus-like particles with improved production and transduction efficiencies”，通讯作者是来自美国怀特海德生物医学研究所的Aditya Raguram研究员和来自哈佛大学的David R. Liu教授，Aditya Raguram研究员的研究方向是使用生物颗粒进行大分子递送，David R. Liu教授的研究方向是精准基因编辑及定向进化方法开发等。使用病毒载体进行货物递送在近年来得到快速的发展，以往利用腺病毒载体（AAV）运送DNA进行编辑的方法通常受到货物大小的限制，并存在整合到宿主细胞基因组的风险。近期通过类病毒颗粒（eVLPs）进行mRNA的装载和递送一定程度上解决了上述问题，但仍存在递送效率低等缺陷。本文通过实验室中定向进化的手段，发现了相比原有的v4突变体递送效率提高2-4倍的v5突变体。
系统使用了一种barcoded sgRNA来特异性地对单种病毒进行标记，首先利用慢病毒转染的手段构建一种用于生产eVLP的工程化细胞平台，在该细胞中含有多个关键质粒，分别负责表达sgRNA和Gag衣壳蛋白-ABE碱基编辑器蛋白、表达Gag衣壳蛋白-pro-pol病毒蛋白酶、表达VSV-G包膜蛋白。用该细胞平台生产出的eVLP具有能够侵染细胞的包膜结构，同时内层包含Gag衣壳蛋白结构偶联着包含有barcoded sgRNA的ABE编辑器蛋白，在linker处结合有病毒蛋白酶。当该eVLP对细胞进行侵染时，所装载的RNP货物分子在细胞中被蛋白酶切割从而释放sgRNA片段，从而对宿主进行基因编辑。比较生产过程或者侵染过程前后细胞和病毒中sgRNA条形码的不同比例，以及考察转导细胞中对相应碱基编辑位点的编辑效率，对病毒生产效率和转染效率进行评估，从而在突变库中筛选出那些效率高的变体。通过调整Gag-ABE结构和Gag-pro-pol结构的比例和衣壳突变体类型，最终筛选出一种GagC507V-ABE+GagQ226P-pro-pol的衣壳组合的v5 eVLP，展示出高达3.7倍的效价提高。
进一步研究发现，v5 eVLPs包括一种关键的衣壳突变，这种衣壳突变能够通过重塑天然的衣壳-病毒基因组相互作用，从而大幅提高RNP货物的装载效率，这在无基因组运载的eVLP中十分重要。这些衣壳突变优化了核糖核蛋白的货物的包装和递送。通过冷冻电镜对v5突变体的病毒结构进行表征，发现相比v4突变体而言，未成熟的衣壳结构比例明显提高，推测v5中的衣壳突变可能抑制了衣壳结构的成熟，同时推测这类衣壳结构并不依赖传统的递送机制，能够获得更高的递送效率。总的来说，本文利用一种barcoded sgRNA标签对病毒进行特异性标记，对不同种类的eVLP在细胞生产和侵染细胞过程中的效率进行比较和筛选，发展了一类新型的定向进化手段，用于筛选不同功能的eVLP颗粒。
本文作者：SHL
责任编辑：WYQ
原文链接：https://www.nature.com/articles/s41587-024-02467-x
文章引用：10.1038/s41587-024-02467-x
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