分享一篇发表在ACS Chemical Biology的文章“Efficient Enzymatic Incorporation of Dehydroalanine Based on SAMDI-Assisted Identification of Optimized Tags for OspF/SpvC” 本文的通讯作者有三位，分别是来自华中科技大学的黄胜友教授、美国西北大学的Milan Mrksich教授以及湖南大学的冯欣欣教授，研究方向分别是生物物理与生物信息学、生物活性材料的开发以及新型抗生素的开发。在本文中，作者团队开发了一种在蛋白中酶法引入脱氢丙氨酸的策略。
蛋白质的位点特异性标记对其生物学功能的研究有着重要的意义。当前比较常见的功能性tag如叠氮、炔基等会在偶联的过程中形成一个比较大的连接基团，这可能会对蛋白功能研究的准确性造成影响。而脱氢丙氨酸（Dha）的引入则可以通过迈克尔加成的方式与多种亲核试剂反应且连接部分仅引入单个原子，但由于其反应活性较强无法通过非天然氨基酸插入的方式直接引入到蛋白中。因此，在本文中作者希望通过利用酶法，以磷酸丝氨酸/苏氨酸作为前体，加入裂解酶OspF/SpvC实现Dha的蛋白原位标记。
由于OspF/SpvC的原有底物为双磷酸多肽序列pT/pS-X-pY，这种比较复杂的结构难以实现蛋白的普适性标记，因此作者首先对底物的序列进行了优化。由于此前研究表明pT/pS的相邻氨基酸（X±1）对酶的催化效率影响较大，作者将邻位分别替换为19种氨基酸，并将361个肽段键合在包被金的表面上，加入酶反应后通过激光照射和后续检测肽段在质谱上的位移来检测酶的转化效率。结果表明，当X±1为芳香族氨基酸（F/Y/W）时，酶的转化效率较高。
为探究这一现象的机制，作者通过分子对接的方式研究了此前筛选出的最优肽段GGY-pT-WGG与OspF的结合模式，结果表明在结合口袋中包含一个亲水部分和左右两个疏水部分，而这使得X±1为疏水氨基酸时底物与酶有更好的结合。而后，作者也通过酶促反应动力学的研究表明简化版的单磷酸底物[F/Y/W]-pT/pS-[F/Y/W]与双磷酸底物pT/pS-X-pY活性相近。
接下来，作者还将这一策略应用到了细菌膜蛋白OmpA的标记上。标记过程如图所示，首先在E.coli中表达了Lpp-OmpA-LPETG，而后通过转肽酶在C端插入前体序列Y-pS-W，加入OspF进行反应和罗丹明成像，结果表明这种策略可以成功实现对细菌外表面蛋白的标记。
总的来说，本文通过对反应底物序列的优化实现了脱氢丙氨酸的酶法插入用于蛋白的原位标记。
本文作者：WYQ
责任编辑：LDY
原文链接：https://pubs.acs.org/doi/10.1021/acschembio.1c00866
文章引用：DOI：10.1021/acschembio.1c00866
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