为大家分享一篇发表在Science上的文章Target-conditioned diffusion generates potent TNFR superfamily antagonists and agonists，通讯作者是来自华盛顿大学的David Baker教授。

设计与靶标蛋白高亲和力、高特异性结合的蛋白质是计算生物学的长期挑战。蛋白质设计通常依赖于预先给定的理想支架，并通过大量对接步骤识别低能结构。最近，生成式AI方法RFdiffusion已被用于设计蛋白结合剂，其中扩散轨迹是在存在固定靶标的情况下产生的，这限制了可实现的形状互补程度，特别是对于表面相对平坦、缺乏微小凹陷(concavities)的靶标。事实上，目前从头设计结合蛋白的接触表面积（CMS）低于许多天然蛋白质复合物。据此，本文作者推测：通过使用RFdiffusion在靶标存在的情况下，从完全随机的残基分布开始直接生成更大的蛋白质，而无需来自预先存在支架的任何指导，可以克服有限的形状匹配。

作者感兴趣的靶标蛋白是肿瘤坏死因子受体超家族(tumor necrosis factor receptor superfamily, TNFRSF)，其中包含多个重要药物靶标，例如TNFR1。TNFR家族成员具有延伸、平坦且高度极性的表面，缺少凹陷和疏水位点，因此是一个困难靶标。David Baker团队此前多次尝试使用RifDock和原版RFdiffusion为TNFR1设计结合剂，但均收效甚微。本文作者尝试将高达120个残基的随机高斯噪声放置在其天然配体TNF的结合界面处，并促使RFdiffusion偏向结合剂与距离较远的数个疏水残基形成接触，以此来提高亲和力。在96个设计的实验验证中有6种设计与TNFR1结合，其中TNFR1_mb1和TNFR1_mb2的KD分别为29和24.5nM，这些设计的接触表面积大幅高于此前RFdiffusion设计的结合剂。作者通过位点饱和诱变(SSM)确定了各个残基对结合的贡献，以此确保设计模型的合理性。

然而，肿瘤坏死因子TNF-α三聚体能以高达19pM的亲和力结合TNFR1，为了超越与单体蛋白的这种相互作用强度，需要进一步提升亲和力。作者没有组合SSM突变的优势单突变体，而是开发了一种部分扩散(partial diffusion)方法，对已有结合剂的主链部分加噪15~25步，随后继续使用RFdiffusion去噪，以此产生类似但不同于原始主链的新结合剂，发现能够将TNFR1_mb2的亲和力提高三个数量级，TNFR1_mb2_pd1对单体TNFR1的亲和力达到<10pM。

考虑到部分扩散可以显著提升亲和力，作者进一步尝试使用类似的方法将结合剂的特异性切换到其他TNFR家族成员，尽管它们的折叠高度相似。作者将已知结合剂对齐至家族成员TNFR2、OX40和4-1BB上，并继续使用部分扩散设计方法，发现能够为TNFR2产生pM级的结合剂，并为OX40和4-1BB产生nM级的结合剂。

最后，作者展示了这些结合剂的治疗潜力。TNFR1结合剂能够有效抑制TNF-α信号转导，且几乎没有脱靶结合。而TNFR2、OX40和4-1BB的结合剂根据其融合寡聚状态的不同，而具有不同的激活/抑制模式。

总之，本文作者证明了可以通过RFdiffusion和partial diffusion相结合，为挑战性的药物靶标设计具有高亲和力、高特异性的结合剂，且实验成功率高于此前的设计流程。