分享一篇angew上的文章，Cysteine-selective phosphonamidate electrophiles for modular protein bioconjugations, 本文通讯作者是柏林洪堡大学化学系的Christian P. R. Hackenberger教授，其课题组的研究方向为开发用于功能肽段与蛋白质合成与修饰的生物正交反应。

   蛋白质的修饰能以两种策略实现：利用非天然氨基酸独特的反应活性或对蛋白源氨基酸侧链的特异性识别。对于后者，发展氨基酸特异性的反应是其重点，最近研究发展了酪氨酸、色氨酸、甲硫氨酸等的特异性修饰反应，但对于半胱氨酸的化学修饰还有许多挑战。半胱氨酸化学修饰手段中最常用的是马来酰亚胺，原因在于其与巯基快速的反应动力学特征。但其最大的缺点在于外源巯基存在时，逆迈克尔加成导致的连接不稳定性。作者以前的工作发现利用Staudinger-phosphonite反应（SPhR），膦酰胺酯能化学选择性地被装载到含叠氮键地蛋白质中，本文中作者利用此方法发展了通过SPhR将含叠氮地分子高选择性地与半胱氨酸偶联的方法。

   乙炔基膦酸二甲酯与叠氮小分子发生SPhR后，富电子的叁键将转化为缺电子，进而导致对巯基的加成反应。作者先将多种含叠氮基团的小分子与乙炔基膦酸二甲酯反应，生成对应的乙炔基膦酰胺酯，对于多种小分子均取得了较好的产率，提纯后也有较好的稳定性。其中部分化合物(3,4)可通过氨基连接上其它基团，如EDANS或Cy5荧光基团。

   作者首先使用GSH作为模型确定了最佳反应条件，接着在曲妥珠单抗上进行验证性的实验。将链间的二硫键还原后，添加不同的亲电生物素衍生物（马来酰亚胺，碘乙酰胺与乙炔基膦酰胺酯）。Western blot结果显示生物素衍生物对巯基10倍当量时，三种衍生物可以取得类似的标记强度。同时为验证对半胱氨酸的化学选择性，在不还原二硫键的情况下进行同样的测试，发现乙炔基膦酰胺酯也有更弱的标记强度，质谱实验也验证了其更好的半胱氨酸选择性。这表明乙炔基膦酰胺酯在大过量下非选择性标记的风险也较小，对不知道蛋白浓度的情况下十分有利。

  作者为测试了连接产物的稳定性，将两个存在FRET的荧光基团连接后，若产物分解则会发出荧光。结果发现产物在PBS，HEK细胞裂解液及人类血清中均可稳定数天。同时将产物暴露在过量巯基中也不会引起巯基的交换。醉着作者比较了生理条件下乙炔基膦酰胺酯标记抗体与马来酰亚胺标记抗体的相对稳定性，将它们分别与BSA在37℃下孵育数天后，用western blot检测BSA上的生物素修饰，结果发现马来酰亚胺标记有迁移，而乙炔基膦酰胺酯标记则稳定。

  最后作者利用此方法将cy5连接到曲妥珠单抗上，形成能选择性结合Her2的荧光抗体。将cCPPs连接到eGFP突变体上，加强eGFP运输到活细胞中的能力。这些结果都说明这种方法能广泛运用于蛋白质与功能基团的连接。

文章链接：

https://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/anie.201814715

文章引用：

DOI: 10.1002/anie.201814715

作者：JGG