分享一篇发表在Cell Chemical Biology上的文章，文章的标题为“Calcineurin: An essential regulator of sleep revealed by biochemical, chemical biological, and genetic approaches”。本文的通讯作者是来自北京大学的饶毅教授。
传统研究睡眠机制的方法依赖于电生理学和遗传学，并且往往只能通过行为观察和物理手段来进行监测，这使得很难进行分子机制和细胞机制的揭示。本文从传统的生物化学和化学生物学方法出发，结合蛋白分级纯化和光交联探针，揭示了钙调神经磷酸酶（calcineurin，CaN、PP2或PPP3）以Ca2+/钙调蛋白依赖的方式使盐诱导激酶（salt inducible kinase 3，SIK3）的T469、S551去磷酸化，从而实现对睡眠的调控。先前的研究报道了SIK3中T469与S551的磷酸化水平和睡眠状态相关。首先，作者利用快速眼动睡眠（rapid eye movement sleep，REMS）和非快速眼动睡眠（non-rapid eye movement sleep，NREMS）作为判据，在基因水平上研究了T469和S551的去磷酸化模拟突变（T469A和S551A）对小鼠睡眠表型的影响。研究发现，这些突变型小鼠的睡眠时间较野生型有所延长，但效果并不显著。因此，他们认为可能在SIK3的上游或下游存在一种调节子能够显著影响睡眠表型。随后，他们分别利用生化纯化和光交联探针两个手段来寻找SIK3的T469以及S551的磷酸酶。首先，作者分级纯化HEK293T细胞裂解液，采用特异性结合磷酸化T469、S551的抗体检测每一组流出液在T469和S551的磷酸酶活性（信号强度与酶活呈负相关）。结果显示，逐级纯化后与T469和S551高度相关的磷酸酶活性显著增加。对最后的流出液进行银染并选择酶活最强的组分进行MS分析，作者最终检验出四种与T469和S551高度相关磷酸酶:PPP3CA，PPP3CB， PPP3CC和PPP5C。
然后，他们利用一种新开发的化学光交联策略PhotoCAX在组织水平上原位捕获小鼠脑切片中的蛋白-蛋白相互作用。PhotoCAX利用曙红Y作为光交联催化剂，在绿光辐照下催化氧气生产单线态氧，活化某些氨基酸（如酪氨酸）的侧链形成亲电中间体。该中间体可与双功能胺弹头形成共价键，从而交联相互作用的蛋白。作者利用这种策略，结合免疫印记分析与定量蛋白质组学手段，定量分析得到相互作用组中与磷酸酶相关的亚基PPP3CA和PPP3R1。由于PPP3CA和PPP3R1主要定位在大脑中，并且分别是CaN最丰富的催化亚基和调节亚基，作者关注于这两个亚基进行后续的实验。最后，他们分别利用过表达PPP3CA、PPP3R1以及对应的基因敲除实验，先后验证了在HEK293T细胞和小鼠大脑中PPP3CA、PPP3R1对于T469和S551去磷酸化的必要性，并分别设计PPP3CA和PPP3R1的敲低小鼠在生理水平上验证这两个亚基对于睡眠的调控作用。综上所述，本文从传统生化与化学生物学手段出发，结合电生理学和遗传学，揭示了CaN对底物SIK3的去磷酸化对于睡眠的调控作用及其分子机制。
本文作者：CJJ
责任编辑：WYQ
文章链接：https://doi.org/10.1016/j.chembiol.2024.12.003
文章引用：10.1016/j.chembiol.2024.12.003
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