分享一篇最近发表在Angew上的文章，题目是“Isotopically Labeled Desthiobiotin Azide (isoDTB) Tags Enable Global Profiling of the Bacterial Cysteinome”, 文章的通讯作者是慕尼黑工业大学的Stephan Hacker博士。Hacker博士的研究兴趣主要是共价抑制剂的合成以及它们作为抗生素方面的应用。

   多重耐药菌感染逐渐成为了人类健康的一个重要威胁，因此发展新型的方法去发现抗生素的可作用靶点是应对未来有效治愈细菌感染的重要手段。化学蛋白质组学是研究活性小分子和配体的蛋白靶点的重要工具，特别是最近发展起来的isoTOP-ABPP (isotopic tandem orthogonal proteolysis activitybased protein profiling)技术能通过竞争的方式高效研究共价抑制剂与靶向蛋白上的结合位点。在isoTOP-ABPP技术中，需要使用到各种条件下酶切、光切和酸切）可以切割的link，为了保证这些link的正交性，往往需要精心设计，也在实验过程中增加了切割的步骤。在本文中，作者开发了同位素标记的脱硫生物素叠氮（isoDTB）标签，并且利用isoDTB标签对金黄色葡萄杆菌（S. aureus）的蛋白质组学中的半胱氨酸位点活性进行了系统的研究。

    首先，作者通过肽段固相合成技术将ε-azido-lysine、两个甘氨酸和脱硫生物素偶联，并在甘氨酸上的引入两个13C和一个15N原子的同位素标记来实现轻重同位素标记，轻重标记的isoDTB存在6 Da的质量差。为了确定isoDTB能够应用到研究蛋白质组中的半胱氨酸位点，作者以甲氧西林敏感的金黄色葡萄杆菌(MSSA）的裂解液进行了isoTOP-ABPP实验，并且与传统的TEV 酶切生物素标签(TEV tags)进行了比较，发现isoDTB不仅能缩短化学蛋白质组学样品的制备流程，相比传统的TEV tags还能增加对鉴定位点的覆盖度。

    随后，作者利用该isoDTB标签对MSSA的半胱氨酸的活性以及可以共价结合配体进行了系统研究。利用高低浓度的碘乙酰胺炔基探针（IAA）进行标记，鉴定到MSSA里88个高活性的半胱氨酸位点。作者在211个亲电性与半胱氨酸反应的小分子库中，根据最小抑制浓度筛选出具有明显生物活性的24种化合物。作者随后利用化学蛋白质实验对这24种亲电小分子在细胞里对半胱氨酸的反应活性进行研究，共鉴定到200个蛋白中的268个半胱氨酸位点，并对这些化合物的promiscuity与可配体结合的半胱氨酸进行了系统分析，这些可配体结合的半胱氨酸组为可能抗生素新的作用机制提供启示。

    最后以β-羟-β-甲戊二酸单酰辅酶A（HMG-CoA）合成酶为例，研究了其111位半胱氨酸与亲电小分子EN106结合后能显著降低该酶催化合成HMG-CoA的活性，暗示HMG-CoA合成酶可以作为抗生物的潜在标靶来干扰细菌的甲羟戊酸的合成通路。

    总之，作者开发同位素标记的脱硫生物素叠氮（isoDTB）标签，并应用到细菌内的半胱氨酸组学研究中，其中鉴定到的可共价结合的半胱氨酸位点可能是未来新型抗生物素重要靶点。

文章链接：https://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/anie.201912075

DOI: 10.1002/anie.201912075

作者：TH