分享一篇发表在JACS上的文章，题目为“Single-Molecule Oxidoreductase Activity Analysis for Activity-Based Diagnosis Based on Proteoform Alterations”，通讯作者为东京大学药学系的Toru Komatsu和Yasuteru Urano教授，他们的主要研究方向为功能荧光探针的设计与应用。
在人类代谢途径中，约有1200种由酶催化的氧化还原反应，其中半数以上以NAD(P)H/NAD(P)+作为共同的辅因子。在前期工作中，作者已经利用NAD(P)H响应的探针实现了活细胞中氧化还原酶活性的高通量测试（Cell Rep. 2021; 36(1): 109311）。另一方面，传统酶活测试方法通常反映生物样本中特定酶的总活性，与其相比，单分子分析可以反映酶亚型、PTM、PPI和折叠状态等蛋白形式（proteoform）变化。在本文中，作者设计了一种可装载单个酶分子的微腔室阵列装置，通过灵敏的荧光读出实现了复杂生物样本中多种氧化还原酶活性的单分子分析。为了实现氧化还原酶的单分子荧光检测，作者首先优化了兼容微器件检测的NAD(P)H响应探针。通过(1)增加探针的发射波长和亮度和(2)增强探针的亲水性，优化的探针Q-sHMRG能够在微腔室装置中稳健地读出心肌黄酶的活性。基于上述微器件和NAD(P)H响应探针，作者尝试测试人类血液样本中的氧化还原酶活性。作者使用的策略为：向以单分子形式装载了血液蛋白质组的微腔室阵列中加入不同的代谢底物，在辅因子和探针的存在下，那些装载了底物所对应的酶的腔室将被点亮，酶的单分子活性可以从腔室的荧光强度信号读出。作者用105种代谢物处理了该装置，成功检测到了血浆蛋白质组种10余种氧化还原酶的单分子信号。作为对照，通过传统微孔板荧光检测方法只能检测到其中2种酶的活性，这一对比凸显了单分子方法对复杂生物样本中背景和非特异信号的排除。该方法的另一优势在于其能够在单分子水平区分酶的不同活性状态，例如作者认为血液和细胞裂解物中G6PDH信号的明暗分簇反映了酶的不同PTM形式，这种区分能力将有望用于酶活性的深度分析。最后，作者将上述方法用于基于活性的诊断。急性肝损伤将导致血液中氧化还原酶活性谱的剧烈变化，作者分析了健康和急性肝损伤模型小鼠血液样本中多种氧化还原酶活性，并成功检测到了此过程中LDH和G6PDH等多种酶活性的变化。更进一步，作者使用该方法在人类脑脊液样本中进行了初步测试，并将G6PDH鉴定为弥漫性大 B 细胞中枢神经系统淋巴瘤（PCNSL）相关的潜在生物标志物。总结而言，本文开发了一种利用微腔室装置和灵敏的NAD(P)H荧光探针检测复杂生物样本中氧化还原酶活性的方法，这种单分子策略有效地改善了传统分析方法中高背景和非特异性的问题，并有望用于临床检测等场景。原文链接：https://pubs.acs.org/doi/10.1021/jacs.4c07624文章引用：10.1021/jacs.4c07624
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