给大家分享一篇近期发表在ACS Omega上的文章，题为Site-Specific Linking of an Oligonucleotide to Mono- and Bivalent Recombinant Antibodies with SpyCatcher-SpyTag System for Immuno-PCR。文章的通讯作者是来自芬兰图尔库大学的Anastasiia Kushnarova-Vakal教授。

抗体-寡核苷酸偶联物（Antibody-oligonucleotide conjugates，AOCs）与抗体-药物偶联物类似，也是一种嵌合生物分子，结合了两种不同类型生物聚合物的独特功能。其中抗体部分提供特异性靶向目标表位的能力，而寡核苷酸部分使得抗体-寡核苷酸偶联物能够获得基于核酸生化特征的广泛应用。例如，基于抗体-寡核苷酸偶联物的药物是一个日益引起关注的应用领域，寡核苷酸部分主要作为靶向的反义序列来实现基因沉默。另外，由于灵敏度高，抗体-寡核苷酸偶联物还应用于不同的检测方法中，如免疫PCR，邻位连接技术等。

制备抗体-寡核苷酸偶联物需要进行两个部分的偶联，而且对偶联过程进行更好的控制对于获得特性明确的偶联物至关重要。当前的偶联策略主要基于赖氨酸与半胱氨酸残基，但由于IgG抗体表面赖氨酸残基众多，这种标记方法表现出较高水平的非特异性与随机性。而利用如链霉亲和素-生物素这样的非共价体系进行偶联，也存在缺乏位点特异性，稳定性较差等问题。相对于这两种方法，引入肽标签或带有修饰的氨基酸是实现稳定且位点特异性偶联的合适方法。在本文中，作者利用SpyCatcher-SpyTag体系作为偶联工具来制备抗体-寡核苷酸偶联物。如图1A所示，在SpyCatcher-SpyTag体系中，CnaB2蛋白被拆分为13个残基的SpyTag短肽和116个残基的SpyCatcher蛋白，而这两部分能够自发形成酰胺键，从而获得共价偶联。

图1. (A) SpyCatcher与SpyTag形成肽键 (B) 两种重组融合蛋白模式图

本文中，作者首先建立了制备抗体-寡核苷酸偶联物的方法，可以分为三个部分：scFv-SpyCatcher的重组表达（scFv, single-chain variable fragment, 单链抗体）、SpyTag002-oligonucleotide偶联物的制备、以及将这两部分的偶联获得最终产物。首先，作者构建了SpyCatcher及AP（alkaline phosphatas， 碱性磷酸酶）-SpyCatcher分别在C端融合的重组蛋白scFv-(AP)-SpyCatcher，其中连接肽部分选择了柔性的（G₄S）₃。如图1B所示，scFv-SpyCatcher为单体，而scFv-AP-SpyCatcher为二聚体。构建的重组蛋白经表达纯化后，通过SDS-PAGE能够检测到与预期分子量近似的条带，如图2A泳道1、3所示。接下来是SpyTag002-oligonucleotide的偶联，如图2B所示，其中叠氮修饰的SpyTag002与5’端带有BCN（2-Bicyclo[6.1.0]non-4-yn-9-yl，双环[6.1.0]壬-4-炔-9-基甲醇）修饰的寡核苷酸通过环张力诱导的的炔-叠氮环加成反应（SPAAC）进行偶联，并通过质谱检测获得的产物。最终，前面步骤获得的scFv-(AP)-SpyCatcher与SpyTag002-oligonucleotide在25℃下PBS缓冲液中进行偶联，并通过尺寸排阻色谱纯化偶联物，进而通过SDS-PAGE分析。可以看出复合物相对于重组抗体分子量大小增加（泳道2相对于1，4相对于3），确认了SpyCatcher与SpyTag间肽键的形成。

图2. (A) SDS-PAGE分析 (B) SpyTag-oligonucleotide偶联物合成

作者随后评估了制备的偶联物应用于免疫PCR中检测低浓度抗原的性能。免疫PCR是结合利用抗原抗体反应特异性及PCR扩增反应的高灵敏性而建立的一种微量抗原检测技术。其中第一步发生类似于ELISA的过程，待测抗原最终间接地与特定DNA偶联，第二步中DNA经PCR过程放大。为了进行实验，作者制备了anti-MC-LR scFv-SpyCatcher-SpyTag002-oligonucleotide，其中anti-MC-LR scFv与MC-LR（微囊藻毒素-LR亚型）及另一种识别ADDA的抗体等形成的免疫复合物特异结合，如图3A小图所示。为检测MC-LR，在添加免疫复合物组分与待测抗原后，加入制备的偶联物，随后通过实时荧光PCR技术对核酸序列进行扩增。结果显示，单体和二聚体检测的循环阈值分别在14.47-7.47与9.87-5.68范围。即使是在2 nM浓度的MC-LR下，循环阈值结果也与不添加MC-LR样品的结果具有统计学显著差异。这一应用验证了制备的抗体-寡核苷酸偶联物各部分的正常功能。

图3. (A)实时荧光PCR检测MC-LR (B)时间分辨免疫荧光分析MC-LR

接下来，为了评估在偶联物制备过程中引入的相关修饰是否会影响抗体在免疫测定中的性能，作者制备了scFv-AP， scFv-AP-SpyCatcher, scFv-AP-SpyCatcher-SpyTag002-oligonucleotide，并将它们作为时间分辨免疫荧光分析(TRFIA)实验中的检测抗体。如图3B所示，结果表明，添加SpyCatcher后，测定的绝对信号降低了27.6%（浅绿）。寡核苷酸的存在进一步使信号降低了20.8%（深绿）。这表明SpyCatcher和寡核苷酸均会削弱抗体与靶标免疫复合物相互作用的能力。

抗体-寡核苷酸缀合物是在体内和体外具有广泛应用的通用工具。本文中作者报道了在生物相容性条件下将带有SpyTag标签的寡核苷酸以共价、位点特异性方式偶联到重组scFv-SpyCatcher融合蛋白上的便捷方法。由于抗体的模块化结构，SpyCatcher-SpyTag系统的小型的尺寸以及重组蛋白的明确的表达流程，该方法可适用于生产不同类型的抗体-寡核苷酸偶联物。同时，使用文中开发的方法制备的抗体-寡核苷酸偶联物也可应用于免疫PCR检测，这也同时验证了偶联物正常的抗原结合功能以及核酸的生化特性。

作者：ZRC 审校：HYL

DOI: 10.1021/acsomega.0c03750

Link: https://pubs.acs.org/doi/10.1021/acsomega.0c03750