介绍一篇发表在Nature Methods上的文章“Super-photostable organic dye for long-term live-cell single-protein imaging”，通讯作者是来自韩国浦项科技大学的Young-Tae Chang，韩国顺天大学的Sung Ho Ryu，Hyung-Ho Ha和Do-Hyeon Kim。
荧光活细胞成像已成为研究蛋白质动态分子活动不可或缺的工具，尤其是单粒子跟踪（single-particle tracking, SPT）技术，可以直接可视化工作中的蛋白质分子，提供它们在单分子水平上动态相互作用的时空信息。然而，目前活细胞单分子成像主要局限于短期时间尺度（低于几十秒），这主要是由于荧光染料的光漂白，即荧光染料在激光照射下荧光信号逐渐淬灭。为解决这一问题，研究人员不断尝试开发光稳定的荧光染料以实现更稳定和长久的蛋白质分子动态成像。在本文中，作者开发了新型有机染料PF555，在活细胞成像中的光漂白寿命比以前已知的光稳定染料长一个数量级，为生理条件下单分子水平的长期活细胞成像提供了强大的工具。
作者开发新染料的思路来源于近期发现的一种有机染料光蓝化现象，在激光激发下，大部分染料被漂白，但有一小部分染料会转化为具有蓝移激发和发射光谱的物质。作者先在细胞中表达了N端Halo标签偶联的EGFR，并用氯烷偶联AF647（CA(O2)-AF647）标记；随后用642 nm激光照射标记的细胞，直到AF647在远红色通道（654-870 nm）中完全光漂白，并产生由561 nm激光激发，572-624 nm范围发射的蓝移新生荧光。出乎意料的是，在光蓝物种中，作者观察到一种超光稳定的化合物。为了纯化这种光稳定物质并阐明化学结构，作者合成了大量的TSCy5 作为 AF647 的简化相似化合物进行体外合成和纯化，作者在自搭建装置中使用了高激光功率和恒定的氧气补充，并纯化出高效液相色谱中的两个候选峰，并表征确认后一个峰（保留时间20.05 分钟，产量0.007%）是新的超级光稳定物种，其激发和发射峰值分别为555 nm和567 nm，作者将其命名为PF555（Phoenix Fluor 555）。
接下来，作者将氯烷烃 （chloroalkane, CA）基团引入 PF555生成CA（O2）-PF555来标记Halo标签融合蛋白。显微镜下，PF555的光漂白寿命为314.4 秒，远高于已有的光稳定染料，且在使用时不需要添加光漂白的拮抗剂。作者随后用PF555观测EGFR内吞和再循环过程，该过程持续了近1小时，可以看到相比于对照条件下EGFR的稳定信号，添加EGF后可以看到EGFR信号减弱发生内吞，并在EGF被洗涤后信号重新逐渐复原恢复到细胞表面。最后，作者还用该荧光分子可视化了单分子EGFR与活细胞中网格蛋白包被结构（clathrin-coated structures, CCS）相互作用的动态过程，结果表明EGFR通过与CCSs周围的连接蛋白发生弱相互作用，来鉴别适合EGFR向细胞内运动时可“骑行”的CCSs结构。总的来说，本文开发了一种用于活细胞成像的荧光染料，有超高的光稳定性，对研究蛋白质分子机制具有重大潜力。
本文作者：FTY
责任编辑：WYQ
原文链接：https://www.nature.com/articles/s41592-024-02584-0
文章引用：10.1038/s41592-024-02584-0
目前评论：