蛋白质的位点选择性翻译后修饰长期以来一直是化学家和生物学家的研究对象。为增强这些生物分子的天然特性修饰以荧光团、药物分子和其他信号部分对我们对生物学的理解和新疗法的创造都具有巨大的价值。虽然在小分子上附着信号部分的工作已经做了很多，但在完整蛋白质上的简易附着却存在困难。蛋白质偶联的主要挑战在于连接大分子时必须克服的空间位阻和大多数天然氨基酸的重复出现而难以产生合适的有选择性的反应柄。当前用于位点选择性合成蛋白质缀合物的方法有引入非天然氨基酸 (UAA)、马来酰亚胺-半胱氨酸连接、内含肽反应和酶促偶联反应。尽管这些方法已经解决蛋白选择性附着上的部分问题，但各自仍然存在一些局限性。

酪氨酸酶是一类广泛分布的酶，涉及生命各个领域的黑色素合成途径，它通常催化酪氨酸氧化成多巴醌中间体，然后环化形成多巴色素。 最近的研究重新研究了商业化的蘑菇酪氨酸酶 (abTYR)，该酶可以靶向不同类型的偶联底物，在N和C端的酪氨酸残基处的催化位点发生特异性的氧化偶联反应。另外部分炔烃和亲核偶联伙伴的位点，如仲胺、苯胺和表面暴露的半胱氨酸残基，扩大了酶蛋白生物偶联的可能位点。这种方法的蛋白附着是通用的，可以在4℃到室温和接近中性 pH 的温度范围内进行，以保持敏感蛋白质的功能。

加州大学伯克利分校的Matthew B. Francis教授近日在J.Am.Chem.Soc.上共同发表了一篇题为“Synthesis of Multi-Protein Complexes through Charge-Directed Sequential Activation of Tyrosine Residues”的研究论文。在这项工作中，作者表征了来自巨大芽孢杆菌的较小的35.5 kDa酪氨酸酶的底物偏好，并表明abTYR无法氧化带负电荷的底物中的酪氨酸，而megaTYR和最近报道的来自古细菌的酪氨酸酶(cnkTYR)反应则可以。作者接下来改造出对特定电荷环境中酪氨酸残基有选择性的新版本megaTYR。之后，作者还利用这种方法通过酪氨酸残基的电荷导向顺序激活 (称为CDSAT) 来构建了蛋白质三聚体。

图1 来自真核、原核和古细菌来源的酪氨酸酶的结构和活性，红色为酸性残基，蓝色为碱性残基。肽反应阵列显示，在将abTYR与非真核酪氨酸酶进行比较时，很明显 abTYR 对负电荷明显更敏感，对任何与末端酪氨酸相邻的具有 3 个或更多酸性残基的肽没有活性。megaTYR则对所有肽底物都显示出高活性，仅在RRRRY肽的情况下活性下降，表明 megaTYR 可以作为高宽容度的酪氨酸激活剂。cnkTYR样品没有显示出可辨别的底物特异性模式。比较三种酪氨酸酶的结构以确定其选择性的晶体解释，abTYR被发现是一种蛋白质复合物并显示出活性位点的显着空间位阻，而megaTYR和cnkTYR是单体并显示出更开放的活性位点。由于它们更可预测的行为和已建立的晶体结构，文章在后续实验中将工作重点放在megaTYR 和abTYR上。然而，进一步探索或改造cnkTyr或许可以产生一种更特异的苯酚单加氧酶，能够以更高的精度发挥作用。

图2 megaTYR(bmTYR)中氨基酸的进化保守性。为了进一步提高megaTYR的活性，作者对megaTYR主干进行了进化保守分析，以确定工程目标位置。使用ConSurf对megaTYR的100个最接近的非冗余同源物进行聚类，并进行多序列比对(图2A)。使用经验贝叶斯方法计算每个位置的标准化保守评分，该方法在构建进化模型时解释了同源物之间的系统发育关系。进化保守被映射到megaTYR结构上，并用于识别具有低保守分数的可变阴离子残基(图2B)。R209也被选为感兴趣的位置，尽管它的保守程度不高，但它在增强双酚酶活性方面有作用，且靠近活性位点(图2C)。

图3 酪氨酸酶突变体的静电计算。探索了abTYR和megaTYR上调节电荷的效果。从文献和保守筛选中选择出的megaTYR突变体在Maestro中使用来自Epik和MacroModel模块的电荷映射工具进行建模，以计算每个蛋白质的表面电位与距离活性位点铜原子14Å的点电荷相比（图 3A)。作者推断靠近活性位点的表面暴露的极性和离子残基可能是有吸引力的目标，因为它们对活性位点电位的影响比更远的残基更大，并以类似的方式对其进行建模。发现abTYR单体的净电位为-4.4V，因为它们表面上有大量酸性残基，对应的等电点(pI)仅为4.41。当abTYR的完整活性复合物被认为是净电势下降到-15.7V。相比之下，megaTYR显示具有+4.4V的净电势和8.66的pI，与观察到的电荷偏好密切相关。根据一个更接近的残基对活性位点电位有更大影响的假设，作者发现R209H突变体的电位为+3.0V，与野生型相比显着降低，而R280H突变体对附近静电的影响要小得多。类似地，D55K突变体在D/E至K的突变中对活性位点电位的影响最大，对应于+7.33V的电位。因此，作者还选择对D55R进行了建模以比较将阴离子残基突变为赖氨酸的影响或精氨酸。虽然D55K的电位为+7.33 V，但D55R的净电位略高，为+7.5 V，这是由于精氨酸的pKa较高而导致的（图 3B）。

图4 megaTYR 的点突变体及对底物的偏好。根据来自保护筛选和潜在建模的数据，作者表达了具有R209H、D55K和D55R突变的megaTYR（图 4A，突变残基突出显示）。在酪氨酸酶浓度为5 U/mL的初始筛选后，观察到R209H降低了megaTYR的电荷偏好，而D55K和D55R增加了对阴离子底物的偏好，如使用EEEEY肽的更高水平修饰（图 4B）。为了评估底物偏好的程度，我们进行了包含相等浓度的 EEEEY和RRRRY肽的竞争分析。在这些测定中，abTYR仅显示出对RRRRY的活性，而R209H显示出对两者的同等偏好（图 4C）。有趣的是，野生型 megaTYR对EEEEY表现出90%的偏好，而D55K突变体表现出95%的偏好，而D55R对阴离子肽的偏好令人惊讶>99%（图 4C）。进一步研究显示，D55R突变的megaTYR对RRRRY肽表现出低转化率，但对电荷较低的阳离子肽保持高水平的活性（图 4D）。正交底物的酪氨酸酶发现可以通过依次偶联阴离子和阳离子标记的亚基来轻松创建复杂的多域蛋白质。这种反应可以类比于肽合成的方式完成，但是可以使用整个蛋白质作为构建模块。

图5为了进一步验证反应正交性，作者接下来比较了 Y200C GFP-E4Y 的 abTYR 和马来酰亚胺介导的生物素化。作为阳性对照，Y200C GFP-E4Y 用马来酰亚胺生物素选择性修饰以生成生物素化的 Y200C GFP-E4Y（图 5D）。同时，在 abTYR 存在下用酚-生物素修饰 Y200C GFP-E4Y，并显示小分子的选择性氧化以提供 Y200C GFP-E4Y-生物素偶联物（图 5E）。将马来酰亚胺和纯化后的苯酚 GFP-E4Y-生物素与 Y200C sfGFP 和 12 U/mL D55R megaTYR 结合30分钟，并通过ESI-TOFMS进行分析。观察到超过70%的底物蛋白转化为由两个GFP蛋白和一个生物素分子组成的三聚体，这使其成为能够构建三组分聚合而无需固体支持物束缚或可移除保护基团的蛋白附着技术（图 5F、G）。

图6 为了评估迭代酪氨酸酶方法用于创建蛋白质三聚体的潜力，Y200C GFP-E4Y 与带有MYGGS标签的纳米荧光素酶和20 U/mL abTYR相结合，以选择性地激活中性荧光素酶标签（图 6A、C）。观察到完全转化为 Y200C GFP-E4Y-纳米荧光素酶二聚体，没有过度氧化。将含硫醇的S152C mCherry作为第三种成分添加到具有 20 U/mL D55R megaTYR 的二聚体溶液中，以连接GFP上的EEEEY标签。这种策略导致顺利转换为mCherry-GFP-纳米荧光素酶的三聚体(图 6D)。从二聚体到最终产物的转化率为100%，表明即使在多蛋白复合物存在的情况下，megaTYR也能够催化阴离子标签上的酪氨酸酶氧化。通过发光和荧光测量进一步验证了构建体身份的三功能性质。在引入纳米荧光素酶底物后，在荧光素酶、GFP和mCherry亚基之间观察到FRET。

本文表明重组表达的酪氨酸酶是各种蛋白质和肽底物上末端酪氨酸残基的成功激活剂。megaTYR突变体筛选的结果表明，细菌来源的酪氨酸酶具有足够的选择性，可以通过形成酪氨酸-半胱氨酸键来介导蛋白质蛋白质偶联反应，并且可以进行工程改造以改变它们的底物偏好。调节这种酶的电荷偏好的成功表明它对突变具有耐受性，并且可以设计为实现与abTYR的正交反应偏好。这些努力的结果是能够根据其电荷或CDSAT顺序激活酪氨酸残基。使用CDSAT创建的蛋白质三聚体表明，系统能够以最小的工程量构建更高阶的蛋白质三聚体，同时通过半胱氨酸位置控制它们的方向。这种多价缀合物将在材料、治疗和诊断应用方面具有巨大的潜力。

https://pubs.acs.org/doi/10.1021/jacs.1c03079?ref=PDF

Matthew・B・Francis 教授

https://chemistry.berkeley.edu/faculty/chem/francis

教育经历

1994 迈阿密大学 化学学士学位

1994-1999 哈佛大学化学科 博士学位 (Eric Jacobsen教授)

1999-2001 加州大学伯克利分校Miller Institute for Basic Research in Science 博士后研究员（Jean Fréchet教授）

2001-今加州大学伯克利分校 The T.Z. and Irmgard Chu Distinguished Professor in Chemistry

编辑：谢诗仪

审核：路栩

推送：章振华