分享一篇发表在Nature上的文章，文章的题目是“Copper-dependent halogenase catalyses unactivated C−H bond functionalization”，通讯作者是美国加州大学洛杉矶分校（UCLA）的唐奕教授和Masao Ohashi。他们的主要研究方向是天然产物生物合成和酶催化机制。
碳氢（C-H）键的卤化是一种非常有用的官能化反应，虽然多种合成方法可以引入卤原子，但控制卤化的区域和立体选择性仍是一项艰巨的挑战。近年来，金属酶催化 C-H 键的卤化成为控制选择性的一种有吸引力的策略。虽然依赖flavin的卤化酶可用于催化多种底物的sp2 C-H键卤化，但对sp3 C-H键的酶法卤化仍很有限。迄今，非血红素铁/α-酮戊二酸依赖性卤化酶（non-haem iron/α-ketoglutarate-dependent halogenase，NHFeHal）是唯一一个催化未活化的C（sp3）-H键卤化的酶家族。作者在此报告了一种之前未知的铜依赖卤化酶ApnU的发现和表征，其可实现前所未有的酶促C(sp3)-H键官能化，如碘化和硫氰酸化。作者将目光聚焦于一个广泛存在于真菌天然产物的生物合成途径中的酶家族DUF3328，之前仅有文献表明其参与C（sp3）-H氧化官能化。作者通过基因敲除和回补实验证实了该家族的一个成员ApnU的催化底物非活泼C（sp3）-H氯化的活性。ApnU含有两个在DUF3328 蛋白家族中保守的 HXXHC 基序。四个组氨酸侧链形成了一个平面的四个角，两个半胱氨酸侧链位于平面下方。这种潜在的金属配位环境与NHFeHals中发现的环境截然不同。作者在大肠杆菌BL21(DE3)包涵体中获得表达的截短ApnU，并使蛋白重新折叠，得到了可溶的ApnU（NΔ75）。为了检测 ApnU 的活性，将重折叠的apo蛋白与抗坏血酸、各种还原剂和二价过渡金属孵育。实验发现，只有在Cu(II)存在的情况下才能实现底物的氯化，且催化需要氧气和抗坏血酸。与NHFeHal催化的卤化不同，在ApnU催化的反应中，副产物主要是去饱和而不是羟化，表明由于金属的不同，催促反应可能存在关键的机理差异。作者接着尝试拓展了ApnU催化官能化的适用范围，发现氯离子可更换为Br-、N3-和NO2-，反应也能发生。有趣的是还观察到了铁基卤化酶中无法实现的碘化、硫氰酸化和硒氰酸化。而氟化物（F-）、氰化物（CN-）、氰酸盐（OCN-）、甲酸盐（HCOO-）、硝酸盐（NO3-）或甲硫酸盐（CH3S-）均未观察到相应产物。作者发现，在ApnU重折叠过程中加入GSH/GSSG氧化还原对是ApnU有功能的关键，提示了半胱氨酸残基的氧化还原状态至关重要。利用LC-(QTOF)-MS分析纯化得到的ApnU活性组分表明，活性ApnU发生了同源二聚。因此作者使用蛋白质组学方法确定了活性ApnU的二硫键的正确连接位置，并使用AlphaFold2和Rosetta预测了二聚体的结构。由于两个HXXHC基序中的C173和C200是二硫键连接的，因此不参与金属配位。作者随后使用残基突变、ICP-MS等确定了铜的配位环境和化学计量（双核铜中心），并进一步通过EPR实验和计算化学手段提出了反应机理。总的来说，作者发现了一种以前未知的卤化酶ApnU，其含有在DUF3328家族中保守的双HXXHC基序，可能与两个Cu(II)金属离子形成金属结合位点。该酶实现了前所未有的C（sp3）-H官能化，并为探索庞大的DUF3328金属酶家族功能提供了蓝图。原文链接：https://www.nature.com/articles/s41586-024-08362-4原文引用：DOI: 10.1038/s41586-024-08362-4
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