分享一篇发表在Cell Chemical Biology上的文章，文章的标题为“De novo designed Hsp70 activator dissolves intracellular condensates”，本文的通讯作者分别是来自华盛顿大学的Jason Z. Zhang和David Baker教授。

热休克蛋白70（Heat shock protein 70，Hsp70）是蛋白质量控制（Protein Quality Control，PQC）的重要组成部分，通过与伴侣蛋白J-domain protein（JDP）相互作用引发构象变化，激活其ATP水解酶活性，从而招募多种客户蛋白，在蛋白折叠、转运以及周转中起到关键作用。近年来，细胞内凝聚体已被发现对细胞的信号转导和基因表达其调控作用，但是其机理尚未完全明晰。因此，本文从头设计了一系列人工蛋白J-domain mimics（JDMs），调节Hsp70的活性，研究其如何影响凝聚体的溶解，进而调控cAMP/PKA信号通路，揭示其在细胞生长和信号调控中的作用。

首先，作者依据先前研究报道的“DnaJB1与RIα相互作用能够减少RIα凝聚颗粒的数目”，构建了包含荧光基团mCherry、GFP抗体GFP nanobody以及DnaJB1的J-domain（JD）的“凝聚体扰动器”结构。将其与RIα-GFP在HEK293T细胞中共表达，作者发现相较于对照组其凝聚体颗粒数目显著下降，表明扰动器的成功靶向。考虑到天然JD与Hsp70的结合能力较弱，作者猜测设计结合能力更强的JDM能够提升对凝聚体的溶解能力。因此，作者采用两种策略，利用Rosetta和AlphaFold2设计了新的JDMs：1）从头设计具有相同结合位点但不具备相似结构和序列的JDMs， 2）结合DnaJ中与Hsp70相互作用的两个螺旋，设计第三个螺旋以提升结合能力和稳定性。最终他们筛选出41种能够有效结合Hsp70的JDMs。

接下来，作者通过ATP周转实验验证JDMs能否激活Hsp70的ATP水解酶活性，溶解凝聚体或促进目标蛋白的折叠，并获得了具有激活作用的JDM37以及抑制作用的JDM16。通过添加Hsp70抑制剂VER-155008，凝聚体溶解效果消失，共同验证了JDM37的激活作用。此外，他们还将JDM37应用于溶解其他的内源凝聚体，例如paraspeckle，利用CRISPR-Cas9系统在NONO、PSPC1、SFPQ等paraspeckle相关蛋白中插入GFP标签，通过相似的JDM37凝聚体扰动器验证其对于paraspeckle的影响。

然后，作者进一步将JDM用于探究凝聚体的信号转导过程。他们利用ICUE3和AKAR4传感器，确定在JDM37激活Hsp70并溶解凝聚体后，细胞内的cAMP水平显著升高，并且PKA活性得到增强。这表明JDM37通过溶解RIα凝聚体，促进了cAMP/PKA信号通路的激活。

最后他们还将JDM37用于研究与肺癌相关的蛋白EML4-Alk形成的凝聚体，并发现JDM37凝聚体扰动器能够溶解这些癌症蛋白凝聚体，降低Ras/Erk信号通路活性，并抑制细胞生长速度。

总的来说，本文通过从头设计Hsp70激动剂，发展了一种调控细胞内凝聚体的策略，为理解凝聚体在信号通路中的作用提供帮助。

本文作者：CJJ

责任编辑：LYC

DOI：10.1016/j.chembiol.2025.01.006

原文链接：https://doi.org/10.1016/j.chembiol.2025.01.006