向大家分享Angew上的一篇文章，题目为Enzymatic C-to-C Protein Ligation。文章通讯作者是昆士兰大学分子生物科学研究所David Craik教授课题组的Thomas Durek高级研究员，该课题组主要研究多肽的工程制造以及其在农药、疾病治疗中的作用。

转肽酶通过特异性识别遗传编码的识别结构域，可催化蛋白、多肽之间的偶联反应，在蛋白修饰与合成中具有重要应用。近期，天冬酰胺内肽酶（AEPs），由于其更短的三肽识别结构域和更高的酶促反应效率，被视为下一代转肽酶。然而，所有已知的转肽酶都只能实现N端-C端的酶促偶联反应，限制了蛋白质偶联产物的潜在种类。因此，本工作基于工程化的天冬酰胺连接酶，致力于发展一种蛋白、多肽C端-C端偶联的酶促反应策略。

[C247A]OaAEP1是工程化的天冬酰胺连接酶，其识别蛋白中Asn-Gly-Leu结构域，并将N端具有Gly-Leu序列的另一蛋白与前述蛋白中的Asn相连接。由于反应副产物Gly-Leu亦可作为反应底物，故上述反应最终仅能达到动态平衡。为解决上述问题，此前的工作在Asn-Gly-Leu序列后额外加入一个His亚基，当反应体系中有Ni2+时，形成的Gly-Leu-His副产物会与Ni2+发生配位作用，进而推动反应平衡正向移动。

本文作者认为，这一淬灭副产物反应活性的策略，同样使得非最优的N端底物的掺入成为可能。作者首先使用Ac-RWRGWRNGLH作为C端模式多肽，在传统N端底物GLRL的基础上发展了一系列底物类似物。实验结果表明，当增加Gly-Leu序列碳链长度，或翻转Leu的手性时，[C247A]OaAEP1均能够兼容上述变化，实现90%及以上的反应产率。

受反向序列肽模拟物的启发，研究人员进一步探究C端类似物是否可以作为[C247A]OaAEP1的底物。作者认为C端Leu-二胺结构可以模拟N端Gly-Leu序列，并合成了碳链长度不等的两种底物。其中，Leu-ethylenediamine (Leu-Eda)序列可以很好地被转肽酶识别，并得到90%的C端-C端偶联反应产率。

基于新发展的C端-C端偶联策略，研究人员接下来建立了一系列应用场景。通过构建一个具有N端GLH序列以及C端Leu-Eda序列的多肽分子，基于Ni2+对两端反应活性的不同影响，上述分子可作为双功能连接基团，实现两蛋白质之间的C端-C端偶联。进一步，通过在中间部分引入对紫外线敏感的非天然氨基酸，作者构建出可光裂解的双功能连接基团。

对于短肽修饰或连接多肽，Leu-Eda序列可以通过固相合成的方法引入修饰多肽中。为直接实现两种蛋白质之间的酶促C端-C端偶联反应，研究人员基于已有的蛋白-硫酯合成技术，通过一步氨解反应完成乙二胺基团的引入，在蛋白质C端构建转肽酶识别序列。基于此，研究人员实现了蛋白间直接的C端-C端偶联，并将其进一步拓展，实现了三元蛋白偶联产物的合成。

综上，本文作者利用工程化的天冬酰胺连接酶[C247A]OaAEP1，基于已有的副产物淬灭策略，有效拓展了该转肽酶的底物范围，并建立了一种蛋白、多肽C端-C端偶联的酶促反应策略。