分享一篇发表在RSC Chemical Biology上的文章，题目为“Functionalization of a versatile fluorescent sensor for detecting protease activity and temporally gated opioid sensing”，通讯作者是来自密歇根大学安娜堡分校的Wenjing Wang教授，研究方向是基于蛋白质的新型传感器。

遗传编码的荧光传感器被广泛应用于检测细胞信号分子和事件。这些传感器具有不同的信号读出方式，用于检测GPCR等受体或蛋白酶的活性，可被分为多组分系统和单组分系统。在单组分系统中，SPOTIT（Single-chain Protein-based Opioid Transmission Indicator Tool）系列具有多功能性和巨大的功能潜力，然而其对于蛋白酶的响应还尚未实现功能化，并且缺少时间门控的控制方式。因此，在本文中作者以cpGFP-Nb39为基础发展了一种新型的荧光传感器 MAturation-based Protease-gated Indicator Tool (MAPIT)，用于检测病毒蛋白酶，并实现了基于小分子的时间门控。

MAPIT包含两个Nb39 nanobody，当阿片类药物存在时，一个Nb39会与受体MOR相互作用，然而另一个Nb39仍与cpGFP结合抑制其发光。当蛋白酶切割事件发生时一个Nb39离去，与cpGFP结合的Nb39结合MOR会释放出GFP从而产生荧光。

首先，由于增加linker的长度可以增加对蛋白酶的通用性，但linker的长度可能影响 Nb39 和 cpGFP 之间的相互作用。因此，作者在单组分系统中优化了linker的长度。他们发现在两侧各15个氨基酸的情况下仍然能够保持28的信噪比（SBR），并且在未切割的条件下不会影响对cpGFP发光的抑制。随后作者针对新冠病毒的蛋白酶Mpro优化了酶切位点的序列，其中VARLQ↓SGF 显示出最佳的 Mpro 依赖性荧光激活。

随后，作者又进一步在细胞体系下检测了MAPIT的特异性，他们发现只有当表达 Mpro时荧光才会被激活，而当表达TEVp或HCVp时均不会被激活，表明传感器对蛋白酶底物的特异性。最后，作者进一步引入了Tet-On系统，建立了Dox激活的Dox-MAPIT传感器。作者在Dox 存在下对 Dox-MAPIT 进行了芬太尼剂量反应曲线，观察到EC50为50 nM，比此前开发的时间门控SPOTIT系统有较大的灵敏度提升。

总的来说，作者开发了一种多功能荧光传感器，用于检测蛋白酶活性和时间门控的阿片类物质感知。

本文作者：WYQ

责任编辑：MB

DOI：10.1039/d4cb00276h

原文链接：https://doi.org/10.1039/d4cb00276h