分享一篇发表在JACS上的文章，题目为“Profiling Proteins Involved in Peroxynitrite Homeostasis Using ROS/RNS Conditional Proteomics”，通讯作者是来自京都大学的Hamachi教授和Hao Zhu助理教授，他们课题组研究方向主要为生物有机化学和生物分子的标记等。

过氧亚硝酸盐ONOO-是超氧化物自由基和一氧化氮自由基反应得到的一种产物，在调节生物体内的氧化还原反应中发挥重要作用，ONOO-及其反应衍生的高能自由基，可能会导致蛋白质氧化和硝化等特定翻译后修饰，进而影响蛋白质功能。而已有的氧化还原蛋白翻译后修饰组学oxPTM，不能专注于观察一种氧化还原活性物种的修饰情况，同时容易遗漏低丰度的特定修饰种类，因此需要开发针对ONOO-的化学蛋白质组学方法。本文开发了一种过氧亚硝酸盐反应性的蛋白标记探针，有助于发现与ONOO-有关的相互作用蛋白。

开发这类探针需要满足几个条件，首先该探针对ONOO-活性物种相比于其他ROS物种有更高的响应选择性，同时具备一定的灵敏度，能够检测低水平的内源性ONOO-物种，并且该探针被激活后能够快速对邻近的蛋白质进行标记。已知该活性物种和苯酚基团反应后会发生硝化和羟基化等反应，因此猜测它们的反应中间体或许可用于邻近蛋白质标记。经过体外实验，作者优化了反应基团的结构，使用2，6-二氯苯酚，该基团能够快速被激活并标记Tyr、His、Lys等氨基酸残基，若将荧光基团与其偶联，就能对蛋白质进行标记。与BSA蛋白进行孵育并经过LC-MS/MS解析，鉴定了在ONOO-存在条件下被Porp-L-M探针修饰的氨基酸，并发现它们大部分都分布于蛋白表面。

在Raw264.7细胞中进行活细胞标记，外加条件控制内源ONOO-物种的产生，该探针能够在免疫刺激下标记与ONOO-有关的蛋白质，通过免疫荧光染色和成像，揭示了ONOO-活性物种主要集中在内质网区域产生。随后作者在蛋白质组水平上通过无标记定量的方法搜索与ONOO-稳态有关的蛋白质，通过GO分析，确认了这些蛋白的生物功能，并辅以荧光共聚焦实验，确认了这些蛋白大部分分布在内质网区域，这说明了内源性的ONOO-物种主要在ER中产生和积累。在这其中筛选到一个与内质网上蛋白质折叠有关的蛋白Ero1a，通过siRNA敲除实验证明了缺乏该蛋白会显著减小标记到的蛋白量，说明了Ero1a可能是ONOO-的来源之一。

总之，作者开发了一种化学蛋白质组学方法，用于标记体系中与ONOO-活性物种产生、修饰和定位相关的蛋白。作者选择了2，6-二氯苯酚作为一种能被ONOO-激活的活性基团，用于标记蛋白质上的多种氨基酸残基，该方法相比于现有的抗体荧光标记技术，反应特异性强，检测灵敏度高，覆盖范围广，证明了细胞内源性产生的ONOO-活性物种存在空间分布的异质性并主要在内质网区域富集，相关蛋白与免疫过程、蛋白质折叠和氧化还原过程等密切相关。

本文作者：SHL

责任编辑：WYQ

DOI：10.1021/jacs.4c14060

原文链接：https://doi.org/10.1021/jacs.4c14060