分享一篇发表在analytical chemistry上的文章：Distinguishing Histidine Tautomers in Proteins Using Covalent Labeling-Mass Spectrometry，通讯作者是来自马萨诸塞大学阿默斯特分校的Richard W. Vachet教授，他们课题组致力于结合化学手段和质谱技术来解决生物学问题。这篇文章中他们利用焦碳酸二乙酯(DEPC)标记实现了对蛋白上组氨酸残基互变异构体的区分。
蛋白中的组氨酸残基存在两种互变异构体，分别为氢原子位于ε位的氮原子上的Nε–H和氢原子位于δ位氮原子的Nδ–H，通常情况下组氨酸更倾向于形成Nε–H的形式，但在某些活性口袋内部例如丝氨酸水解酶中，组氨酸的主要形式为Nδ–H。传统的区分方式需要测定二维核磁以及估计对应组氨酸残基的pKa，考虑到常用的蛋白标记试剂DEPC很容易与组氨酸残基反应，并能与两种互变异构体形成不同的产物，因此本文作者希望用DEPC标记的方式对互变异构体加以区分。
由于组氨酸残基中未结合氢原子的氮上存在一对未参与共轭π键的孤对电子，更易与亲电性的DEPC反应，产生+72.02Da的分子量上升，因此理论上可以通过这种方式使得两种互变异构体形成酯基位于不同位置的衍生物，进而通过色谱进行区分。作者首先在模型短肽上进行测试，发现两种互变异构体形成的衍生物能够很好地在色谱上进行区分，产生两个具有相同m/z的峰，且二者的比例约为3.9 : 1，与理论上无结构多肽中Nε–H : Nδ–H = 4 : 1的比例一致。为了确定色谱上的两个峰是否确实对应了Nε–H和Nδ–H异构体，作者考察了两条多肽二级谱中几种离子的强度，发现含量更高的异构体的二级谱中a3/b3离子强度的比值更高，这也与理论上Nδ–H异构体在质谱碎裂时能够形成稳定的五元环状b3离子，而Nε–H无法形成五元环，进而易丢失一分子的二氧化碳产生a离子的现象是一致的。
为了证明两种互变异构体中的亲核性氮原子有一致的与DEPC的反应活性，作者测试了多条多肽，在保持反应时间1min的条件下改变DEPC的处理浓度，结果显示产物中两种异构体的比例基本维持稳定，侧面说明了两种互变异构体与DEPC的反应活性是一致的。他们同时发现对于不同多肽，Nε–H总是具有更长的色谱保留时间，说明无需通过逐一的二级谱解析也可对两种异构体加以区分。
最后作者在肌红蛋白和微球蛋白β2m上测试了他们开发的标记手段，将蛋白经过标记再酶切后用LC-MS/MS进行鉴定，在肌红蛋白的11个His中，作者成功确定了7个His上的互变异构体比例，其中包括5个已有NMR结果报道的位点。在5个有已报道结果的位点中，3个与作者测得的结果基本一致，另外两个位点作者认为可能由蛋白种属的差异或核磁结果不可靠导致。总之，这篇文章中作者利用DEPC标记实现了对蛋白中His残基不同互变异构体的区分。
本文作者：LDY
责任编辑：LYP
原文链接：https://pubs.acs.org/doi/10.1021/acs.analchem.1c03902
原文引用：DOI：10.1021/acs.analchem.1c03902
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