分享一篇发表在Journal of American Chemical Society上的文章，题目为“An mRNA Display Approach for Covalent Targeting of a Staphylococcus aureus Virulence Factor”，通讯作者有三位，分别是来自基因泰克公司多肽治疗研究部门的Alix I Chan和Christian N. Cunningham，以及来自斯坦福大学的Matthew Bogyo教授，他的工作围绕水解酶的功能和探针开发展开。

共价抑制剂类药物可以与靶蛋白的亲电结构形成共价键，其更强的相互作用可以提升药物的疗效、特异性，并降低耐药性。共价抑制剂的理性设计通常依赖于靶蛋白的结构信息，在缺乏蛋白质结构信息的情况下，共价抑制剂的从头设计通常采用高通量筛选的方法，例如使用遗传编码的文库进行抑制剂筛选，其中就包括mRNA展示技术，这种技术能在肽或蛋白质翻译的过程中或翻译后掺入共价弹头，并可以通过灵活的体外翻译（the Flexible In vitro Translation，FIT）系统，将多种非天然氨基酸掺入肽库中。

作者团队于2018年使用FP（fluorophosphonate）探针和基于活性的蛋白质组分析 （ABPP）发现了金黄色葡萄球菌中的一个新型丝氨酸水解酶家族，FphB是其中一员，它是一种膜蛋白，对于宿主内特定组织的有效细菌定植很重要。因此，在这篇文章中，作者使用了一种含有恶二唑酮共价弹头的非天然氨基酸OxF来进行金黄色葡萄球菌丝氨酸水解酶FphB的共价环肽探针的筛选。

作者首先设计了一种基于恶二唑酮的弹头片段JJ-OX-009，并将其连接到含有酮修饰的非天然氨基酸中构筑非天然氨基酸OxF-CME，随后通过酰化修饰的方式与tRNA偶联。作者通过NanoBiT发光测定法测试了其体外翻译的效率，大约是苯丙氨酸的50%左右。

接下来，作者使用了基因重编程体外翻译（IVT）系统和mRNA展示方法。作者首先生成了由6-10个氨基酸组成的大环肽的文库并进行体外翻译和筛选，每个肽由一个N-氯乙酰化氨基酸引发，该氨基酸与下游半胱氨酸巯基反应形成环化，每种肽都含有一个恶二唑酮弹头，弹头在大环中的位置并不相同。作者利用FphB对该文库进行了五轮定向筛选，并对富集得到的环肽序列进行了聚类分析，从中选择了FphB-OX-14和FphB-OX-5进行后续的合成和验证。作者通过蛋白质谱实验和突变体实验证明了标记是共价不可逆的，并且是活性依赖性和位点特异性的。作者通过突变扫描实验而证明了环肽对FphB的活性完全依赖于序列。作者还通过AlphaFold2的建模结构进行了环肽和FphB的分子对接模拟，预测了环肽共价抑制FphB的方式。

最后，作者基于FphB-OX-14和FphB-OX-5，合成了可以在金黄色葡萄球菌中进行活细胞荧光标记的荧光探针，进行了活菌的荧光成像，以及慢性金黄色葡萄球菌感染小鼠模型的活体成像。

总之，作者基于重编程体外翻译系统和mRNA展示方法，构建了含有恶二唑酮共价弹头的环肽文库，针对FphB进行了共价环肽抑制剂的筛选。

本文作者：ZCL

责任编辑：LZ

DOI：10.1021/jacs.4c15713

原文链接：https://doi.org/10.1021/jacs.4c15713