分享一篇发表在JACS上的文章，题目是“Profiling Nascent Tumor Extracellular Vesicles via Metabolic Timestamping and Aptamer-Driven Specific Click Chemistry”，通讯作者是来自厦门大学的宋彦玲教授，主要研究方向是液体活检和微流控分析。

几乎所有类型的细胞都会释放胞外囊泡（Extracellular vesicles, EVs），对新生的EV进行分析可以更精确、更及时地了解特定刺激下EV的动态调控，因此，对新分泌的EV进行定量和蛋白质组学评估十分重要。然而，传统的EV分离方法，包括基于沉降速率的超速离心、基于大小的分选和基于生物标志物的亲和富集等，主要依赖于EV固有的生物学特性，难以将EV分析扩展到时间维度上。

为此，作者开发了STAMP技术（specific click-tagging driven by aptamer for tEVs labeled with a metabolic timestamp），将非天然糖的代谢标记与适配体驱动的点击化学反应结合，能够在区分新生肿瘤胞外囊泡（tEVs）的同时，增强EV标记的特异性，进行EV分泌的定量和蛋白质组分析。

作者首先对通过非天然单糖进行代谢聚糖标记（metabolic glycan labeling, MGL）的方法进行了验证。作者采用四乙酰化 N-叠氮基乙酰甘露糖胺（Ac4ManNAz）作为前体，将叠氮基团通过代谢标记的方式引入人黑色素瘤A375细胞EV的膜糖蛋白上，同时将其作为时间零点的标志（即时间戳），随后，作者用超速离心的方法分离EV，用DBCO-Cy5对叠氮基团的标记情况进行检测，成功证实了叠氮基团在EV上的引入。

接下来，作者使用该方法，对EVs进行了微流体检测。在代谢标记后，作者加入100 nM的生物素-SYL3C-DBCO探针对新生EV进行捕获，捕获结束后，加入SSB（Single-stranded DNA binding protein）破坏适配体-探针之间的非共价可逆结合作用，最后采用含有链霉亲和素的微流控芯片进行EV的富集，在这个流程中，只有带有叠氮基团的新生EV被富集。并且，使用DNase对适配体进行切割后可以将富集的EV从芯片上释放出来，对其蛋白组进行检测。

在活体层面，作者选择4T1荷瘤小鼠作为模型，利用STAMP检测PD-L1抗体免疫治疗后新生的EpCAM阳性EV。作者在小鼠种植肿瘤的第7天进行PD-L1治疗，并同时通过瘤内注射和腹腔注射组合的方法使用Ac4ManNAz进行代谢标记作为时间戳，区分治疗后的新生EV。作者在注射后的不同时间点收集血浆进行STAMP流程的EV分析，发现PD-L1治疗可以使EpCAM阳性的EV下降，与预期相符，并与肿瘤体积的减小存在相关性。作者还对STAMP方法富集的tEVs进行了蛋白质组分析。在治疗组中，共有189种蛋白质的丰度显著降低，而299种蛋白质的丰度显著增加。作者在新生EVs中找到了92种特异性增加的蛋白，其中包括热休克蛋白HSP70，表明HSP70可能作为免疫治疗后EVs的膜生物标志物，且HSP70在EV中的上调可以抑制肿瘤细胞生长。

总之，作者开发了STAMP技术，可以在区分新生tEVs的同时对tEVs进行定量和富集。

本文作者：ZCL

责任编辑：LZ

DOI：10.1021/jacs.5c01973

原文链接：https://doi.org/10.1021/jacs.5c01973