分享一篇发表在JACS上的文章，题目为Short Oligonucleotides Facilitate Co-transcriptional Labeling of RNA at Specific Positions，通讯作者是来自上海交通大学的刘昱特别研究员。

对于与RNA相关的研究和应用，对RNA分子的位点特异性标记十分重要，但对长RNA进行天然共合成标记，而不是合成后标记，仍然充满挑战。共合成标记在选择标记位点时具有更大的灵活性，还可以最大限度地减少对RNA结构或功能的干扰，并减少降解。因此，作者在本文中建立了一种共合成标记方法SMRITI，其中前导RNA在暂停-重启模式后，通过工程转录复合物催化的反应，在混合固液相上发生延伸。另外，作者使用定制设计的短寡核苷酸链来破坏前导RNA末端的二级结构，使之充分与模板结合。这种共转录标记方法能够以高产率和极大的灵活性，对目标RNA进行标记。在本文中，作者成功地将几种天然修饰、荧光核苷酸类似物和供体-受体荧光团引入内部环、假结、连接点、螺旋和各种连续相同核糖核苷酸中的特定位点中，克服了现有方法在效率和位点特异性方面的限制。

图1. 利用SMRITI对RNA进行位点特异性标记的示意图。

为了对RNA进行位点特异性标记，作者设计了一种工程化延伸复合物（engineered elongation complex, EEC），由DNA模板（灰带）、非模板（灰带）、LRNA（黑线）、短辅助DNA（橙线）和RNAP（黄色球）组装而成。作者这种EEC的一个显著特征是，除了未配对的气泡部分，模板和非模板DNA形成了互补双链，从而使LRNA与气泡中的DNA模板杂交。另外，通过添加与LRNA 3’端互补的辅助DNA，可以有效破坏LRNA的折叠，保证末端的释放，显著提高了EEC的组装效率。EEC的另一个突出特点是，作者将生物素标记的DNA固定在链霉亲和素包被的珠子上，反应体系为混合固液相，这使LRNA在暂停-重启后进行延伸，并在特定位点进行RNA标记。

一轮SMRITI反应的步骤如图1蓝色箭头所示。首先，通过添加少于四种类型的NTP（包含带有标记的NTP），RNAP从LRNA末端开始，在25或30°C环境中延伸10分钟，在缺少对应NTP的第一个位点暂停。在经过冲洗和固液分离之后，通过添加包含缺失NTP在内的新NTP混合物重新开始延伸。通过这种方式，可以使用不同的NTP（少于四种）重复暂停和重新启动延伸，以根据需要在特定位置添加带有修饰的NTP。在转录超出待标记位置后，作者通过添加完整的NTP混合物（四种类型的NTP）来转录获得全长RNA，无需人工暂停。在SMRITI结束时，通过将含有标记产物的液相与固相分离来回收产物。

图2. 利用SMRITI合成PRF的条件优化。

作者接下来优化了SMRITI的相关条件，发现对于PRF (programmed ribosomal frameshifting RNA from SARS-CoV-2) 的合成，仅在辅助DNA存在时才会出现全长RNA产物（图2A、B）。作者测试了不同的辅助DNA，用来从LRNA中释放0-15 nt末端，发现6-15 nt的自由端最适合气泡长度为9 nt的EEC的组装（图2C）。在作者的设计中，RNA末端只有8 nt与气泡互补。因此，一个6-15 nt的自由端就可以形成一个6-8 bp的RNA-气泡杂交体。作者通过改变气泡区域内的序列，进一步确定了RNA-气泡杂交体的最佳尺寸。当RNA-气泡杂交体长度为4-8 bp时，SMRITI的产量随着杂交长度的增加而增加（图2C）。另外，气泡的大小也影响了SMRITI的产量，12 nt的气泡的产量明显低于9或10 nt的气泡的产量（图2C）。

图3. SMRITI合成的修饰PRF在稳态荧光和smFRET研究中的应用。

作者接下来尝试利用SMRITI策略，在来自SARS-CoV-2的PRF的假结区域（位点91和93）引入荧光核苷酸类似物2AP（图2A、3A），并通过稳态荧光滴定法监测在这些位点，由Mg²⁺引发的结构变化（图3B）。作者发现，通过SMRITI产生的91AP-和93AP-PRF的产率均约为25%。有趣的是，在添加Mg²⁺后，作者观察到91AP-PRF和93AP-PRF出现了相反的荧光变化（图3B）。其中91AP-PRF的荧光随着2 mM Mg²⁺的添加而增加（红色曲线，图3B），表明该位点发生了结构变化，导致2AP更多地暴露于溶剂中。相反，Mg²⁺的添加导致位点93处的荧光降低（蓝色曲线，图3B），表明位点93形成了更紧凑的折叠结构，可能是因为与新形成的假结形成了更紧密的堆叠。

smFRET是一种在单分子水平上监测RNA结构动力学的强大技术，然而，这种方法需要将一对双色荧光团引入RNA的特定位点。作者通过SMRITI，将供体-受体对Cy3-Cy5修饰到了位点53和97上（图2A），产率约为16%。在12%变性PAGE中，Cy3Cy5-PRF可以被530和620 nm的荧光激发，这表明两种荧光团都成功被掺入了RNA样品中（图3A）。作者将纯化的Cy3Cy5-PRF与13 nt的生物素化DNA链杂交，并将其固定在石英表面，以进行smFRET（图3C）。随后，作者在没有Mg²⁺的情况下，对Cy3Cy5-PRF进行了smFRET测量，产生了E_FRET直方图（图3D）。作者将该直方图与两个高斯峰拟合，得到了一个低FRET峰（E_FRET∼0.2）和一个高FRET峰（E_FRET∼0.8）。这表明在没有Mg²⁺的情况下，至少存在两种不同的具有假结相互作用的构象。其中大约68%的PRF处于高FRET构象，与晶体结构中假结的形成一致。作者通过添加2 mM Mg²⁺，产生了明显更高的高FRET构象群（图3D）。然后，作者对单个Cy3Cy5-PRF分子进行了探究，以进一步鉴定SMRITI法对PRF的标记效果，这不仅证实了供体和受体被标记到了一个RNA分子中，而且还证明了在添加Mg²⁺后，RNA的动态性较低（图3E），表明Mg²⁺有助于PRF中假结的形成和稳定。

图4. SMRITI将天然修饰的核苷酸插入到riboA的内部环中。

作者接下来尝试通过SMRITI，将六种常见的天然修饰，包括m⁶A、m¹A、m⁵C、Ψ、m¹Ψ和mo⁵U，修饰到腺嘌呤核糖开关的位点38、39或40上（图4A）。利用SMRITI方法，作者合成了各种版本的、仅标记了位点38、39和40之一的riboA：其中m⁵C标记在位点38上、Ψ/m¹Ψ/mo⁵U标记在位点39上，或m¹A/m⁶A标记在位点40上。在获得对应的修饰riboA后，作者使用停流动力学监测了其结构和功能的改变，并将未添加NTPs或添加了天然NTPs的组作为对照。如图4B，添加了U和m⁵C、U和C，或U（无C）的组分别产生了38 nt带有m⁵C的RNA产物（泳道1）、38 nt RNA（泳道2）或37 nt RNA（泳道3）。泳道1和2中的RNA产量相似，说明在SMRITI中，T7 RNAP插入m⁵C和C的活性是相似的（图4B，C）。而正如作者预期，泳道2和泳道3之间具有明显差异，说明T7 RNAP可以区分U和C，从而使转录暂停。第4、5和6泳道显示了作者利用SMRITI，将mo⁵U、Ψ和m¹Ψ修饰到位点39的产量（图4B、C）。基于泳道4、5和6中也观察到了较短的RNA片段（38 nt），作者认为T7 RNAP将这些修饰的UTP，尤其是mo⁵U，修饰到RNA中的能力低于天然的U（泳道4和7)。另外，作者发现，掺入m¹Ψ和Ψ的产量略低于天然UTP (图4C)。m⁶A的掺入产量与天然的A相当；然而，m¹A几乎没有被T7 RNAP掺入RNA，这可能是因为N1上的甲基破坏了A和T之间的氢键（泳道9-12，图4B）。基于上述结果，作者表明，Ψ、m¹Ψ、mo⁵U、m⁵C和m⁶A可以通过SMRITI方法被准确地整合到RNA中，并且将m⁶A和m⁵C引入RNA的效率与其天然对应物相当，高于m¹Ψ、Ψ和mo⁵U（图4C)。

图5. 带有各种天然修饰的riboA的停流动力学。

在获得修饰版本的riboA后，作者通过25至52°C的停流荧光动力学，研究了单个Ψ、m¹Ψ、mo⁵U、m⁵C或m⁶A对riboA结构的影响（图5）。作者利用能以低μM亲和力与riboA结合的2AP分子来进行对修饰的riboA的停流荧光研究。在25°C时，2AP的荧光在与天然或修饰的riboA样品混合后降低，而修饰样品导致2AP荧光的变化幅度比天然RNA更小（图5）。这表明修饰的核糖开关RNA仍然可以结合配体，但这些修饰确实损伤了核糖开关RNA的结合口袋。作者发现，在25°C时，Ψ和m¹Ψ对RNA的配体结合能力的破坏最小，而m⁵C掺入的影响最大（图5A-D）。WT和修饰riboA在25至52°C下的动力学如图5E所示，虽然m⁵C在25°C时产生的荧光变化要小得多，但其结合2AP的反应比WT更快。而除m¹Ψ-riboA和Ψ-riboA外，WT和修饰的riboA之间的差异随着温度的升高而更加显著，例如，m⁵C-riboA和m⁶A-riboA在52°C时几乎不与2AP反应（图5C、D)。

图6. 利用SMRITI对连续相同核苷酸进行内部位点特异性标记。

接下来，作者尝试对几个相同核苷酸区域的内部进行位点特异性标记，在1小时内通过2步SMRITI，将Cy3荧光团标记到位于UUU中间的位点36（图6A）。作者通过RP-HPLC来分离具有零个、一个或两个Cy3基团的riboA样品，在所用的实验条件下，疏水性Cy3将RNA在C8柱上的保留延迟了约2分钟（图6B）。作者还进行了逆转录实验以确定修饰位点的位置，使用FAM标记的DNA引物来检测副产物。作者发现，大多数36Cy3-riboA都被逆转录为riboA的全长DNA产物（泳道2和3，图6C），但也检测到了截短的RT产物（绿色星号，图6C）。这说明Cy3对逆转录酶的抑制作用不是很明显，可能是因为修饰位于碱基而不是核糖，导致逆转录酶没有完全停在标记位点，而是停在标记位点的下游1 nt的位置（图6C）。另外，当作者在RT反应中分别使用36Cy3-和37Cy3-riboA作为模板时，检测到的截短的RT产物的长度差异为1 nt（泳道3和7，图6C)。这一观察表明，可以通过SMRITI实现对RNA中连续核苷酸的特定位点进行精确标记。随后，作者通过稳态荧光光谱表征了36Cy3-、37Cy3-和3637Cy3-riboA的光物理特性，发现所有标记riboA的荧光随着配体腺嘌呤的添加而降低（图6D-F），这可能是由于在添加腺嘌呤后，U36的翻转可能会使与36或37共价连接的Cy3解堆叠，导致荧光降低（图6D、E）。但是，双重标记的样品3637Cy3-riboA对配体的反应不如单标记的样品敏感。这可能是因为相互作用，例如两种Cy3染料的堆叠抵消了U36翻转引起的解堆叠效应，导致添加腺嘌呤后引起的3637Cy3-riboA的荧光变化可以忽略不计（图6F）。

图7. 使用三种策略（SMRITI, PLOR, 以及二者结合）来合成带有一对FRET基团的riboC链 (＞200 nt)。

基于上述结果，作者尝试利用SMRITI对长RNA(>200 nt)进行位点特异性标记。作者利用两个连续的SMRITI反应，生成了Cy3Cy5-riboC（蓝色箭头，图7A），总产率高于10%。而利用PLOR（绿色箭头）或偶联PLOR和SMRITI方法（橙色箭头）获得相同产物的步骤更多但产率更低。作者计划对位点47和185进行标记，这两个位点分别靠近发夹L5和L13（图7A）。基于riboC的晶体学数据和分子动力学模拟结果，riboC在两个发夹之间形成了一个稳定的kissing loop (KL)。作者通过将Cy3Cy5-riboC与生物素标记的DNA杂交固定在固相上，利用smFRET来研究KL在单分子水平上的动力学（图7C，D）。作者通过smFRET监测了添加Mg²⁺和AdoCbl后Cy3Cy5-RNA的动态变化。在没有Mg²⁺的情况下，作者仅观察到低FRET（~0.25），表明不存在KL（图7C）。而在添加2 mM Mg²⁺后，分子从低FRET（~0.25）状态变为高FRET（~0.6）状态（图7C），表明在L5和L13之间动态形成了KL。Mg²⁺(2 mM)和AdoCbl (100 μM)都显著增加了高FRET状态的比例，其中Mg²⁺增强了两种FRET状态之间的转换动力学，而AdoCbl稳定了RNA的构象，这对于riboC响应AdoCbl从而转换功能至关重要（图7D，右）。

总之，作者在本研究中，建立了一种高效简便的RNA位点特异性标记的策略SMRITI，可用于将包括荧光团、核苷酸类似物和几种天然修饰等各种类型的标记引入长RNA、假结、连续相同核苷酸中的特定位点中。

文章编号:239

原文链接: 

https://pubs.acs.org/doi/10.1021/jacs.2c00020

原文引用: 10.1021/jacs.2c00020