分享一篇发表在JACS上的文章，题目为Antigen-Specific T Cell Detection via Photocatalytic Proximity Cell Labeling (PhoXCELL)，通讯作者是来自南京大学的李劼教授和北京大学的陈鹏教授。
示意图1.通过PhoXCELL对抗原特异性T细胞进行时空可控和定量的标记和检测
抗原特异性T细胞的定量检测和表征对于理解免疫反应以及开发新的免疫疗法至关重要。本文中，作者报告了一种通过光催化进行邻近细胞标记(PhoXCELL)来检测和量化细胞间相互作用的时空分辨方法（示意图1）。作者对具有生物相容性的光敏剂二溴荧光素(DBF)进行了优化，用于通过光催化在细胞表面产生单线态氧，随后用基于脂肪族伯胺的探针来标记附近的氧化蛋白质。作者证明了可以通过快速光照，利用DBF功能化的树突状细胞(DC)，对在免疫突触中具有相互作用的T细胞进行时空标记，且这种标记可以定量区分具有不同相互作用强度的T细胞，揭示了与抗原特异性DC具有强烈相互作用的T细胞的不同基因特征。此外，作者使用PhoXCELL，在小鼠肿瘤模型中同时检测到了来自肿瘤浸润淋巴细胞和引流淋巴结中的肿瘤抗原特异性CD8+和CD4+ T细胞，证明了PhoXCELL可以作为识别抗原特异性T细胞的强大平台。
图1. PhoXCELL作为一种非遗传策略用于邻近细胞标记的开发和验证。
作者之前开发了一种识别单甘氨酸的分选酶A(mgSrtA)，可用于对多种类型细胞的表面进行标记。作者采用这种非遗传策略，将DBF引入了目标细胞表面。作者设计并合成了一种与LPETGG肽连接的DBF光催化剂作为mgSrtA的底物，对蛋白质N端的单甘氨酸残基进行标记。通过这种方法，作者成功将DBF-LPETGG引入了包括原代骨髓衍生树突状细胞(BMDC)在内的细胞表面(图1a)。荧光成像和流式细胞术的结果都清楚地表明，DBF有效地结合在了细胞表面（图1b）。作者接下来系统地优化了带有DBF标记的细胞表面上的光催化标记反应，作者选择了三个波长的光，来测试经过光氧化后，包括伯脂肪胺、醇、硫醇、芳香酚、苯胺和萘胺在内的各种亲核生物素探针的标记能力（图1c）。作者发现，当使用DBF修饰的BMDC作为模型细胞时，生物素醇（BAl）在所有三个波长下都没有显示出标记信号。而生物素硫醇（BMe）、生物素酚（BP）、生物素苯胺（BAn）和生物素萘胺（BNap）都具有较高的背景标记水平（在光照射下，在没有光催化剂的细胞上产生的标记信号），限制了它们的进一步应用（图1d−f）。相比之下，生物素伯胺（BAm）在480和520 nm光照下都显示出了显著的标记信号（图1e、f），且在没有DBF的情况下，细胞在520 nm处具有较低的标记背景（图1f）。因此，作者选择了生物素伯胺探针和520 nm波长作为临近细胞表面标记的最佳条件，使用该优化条件，作者通过共聚焦成像证明了在所需的空间分辨率下，细胞膜上有清晰的标记信号（图1g）。
图2. PhoXCELL能够在体外对抗原特异性T细胞进行时空可控的捕获。
作者接下来将抗原特异性树突状细胞和OT-I T细胞之间的相互作用作为模型，来表征这种用于细胞间标记的光催化系统。研究者们已经开发出一种转基因OT-I TCR，其可以特异性识别卵清蛋白（OVA）的257−264表位（SIINFEKL）。通过在DC上呈现含该表位的MHC-I，再使用转基因的OT-I T细胞，可形成稳定的DC−T细胞相互作用突触。作者先将未成熟DC（iDC）使用SIINFEKL肽引发（prime），并进行DBF功能化，再与OT-I T细胞共培养，然后在光照射下进行PhoXCELL介导的生物素化标记（图2a）。流式细胞术的结果表明，可以在靶OT-I T细胞上特异性和有效地检测到生物素信号（43%），而无关抗原引发的或未引发的iDC仅诱导产生了背景标记（1−4%）（图2b、c）。同时，在与抗原特异性DC相互作用后的1小时内，早期T细胞活化标记物CD69迅速上调。如图2b所示，仅CD69+激活的OT-I T细胞会被选择性标记，说明了利用PhoXCELL，通过DC−T细胞相互作用来捕获抗原特异性T细胞这一方法的特异性。随后，作者描述了PhoXCELL在细胞表面进行时空标记的能力，并证明可以通过光照射来快速打开或关闭单线态氧诱导的细胞标记作用（图2d）。此外，为了探究相互作用细胞上的标记区域，作者对经过PhoXCELL的离体DC-T细胞簇进行了共聚焦成像，并在相互作用突触中观察到了明显的生物素信号（图2e）。总之，PhoXCELL诱导的细胞间标记由于单线态氧适当的扩散半径而可以在免疫突触中实现精确的空间控制，并且光催化的打开/关闭也可以实现时间控制。
图3. PhoXCELL能够对细胞间相互作用进行定量检测和分析。
抗原特异性T细胞和抗原呈递细胞之间的TCR-pMHC相互作用的不同强度影响了T细胞响应的幅度和质量。PhoXCELL的时空控制能力促使作者进一步探究了PhoXCELL能否区分DC−T细胞相互作用的强度。作者设计了一个包括一些改变的肽配体（APL）的系统，来调节OT-I T细胞和iDC之间的相互作用强度（图3a）。相比于原始SIINFEKL（N4）肽，这些APL包含不同的单氨基酸取代，它们与iDC细胞上的MHC-I H-2Kb结合的亲和力与N4相同，但与OT-I T细胞上的TCR相互作用的效力不同。作者用带有不同浓度APL的DBF-iDC作为诱饵细胞，并使用PhoXCELL来评估其与OT-I T细胞相互作用的能力。作者发现，在抗原特异性相互作用的过程中，带有不同APL的iDC诱导了OT-I T细胞上CD69的不同表达水平。作者发现，当APL浓度从100 nM降低到1和0.1 nM时，临近标记信号随着CD69的减少而降低，其中低亲和力的肽诱导产生低标记率和低CD69表达量（图3b−d）。与CD69的表达不同，PhoXCELL产生的生物素信号仅依赖于相互作用时的邻近标记，而不受其他类型刺激的调节。因此，这种仅依赖相互作用的生物素信号代表了对细胞间相互作用的一种备选化学标记，可用于定量检测抗原特异性T细胞。为了进一步研究在不同强度下与iDC相互作用的OT-I T细胞的表型和功能特征，作者通过批量RNA测序（图3e）表征了由N4引发的（N4-Bio+）和V4引发的（V4-Bio+）DBF-iDC标记的Bio+亚群的转录谱。作者发现，与V4 Bio+组相比，在N4 Bio+组中，215个转录本显著上调，而228个转录本下调（图3f，g）。基因本体（GO）分析表明，215个上调基因主要集中在细胞分化、细胞通讯、胞间粘附等生物过程中，这些过程与细胞因子活性等分子功能的富集一起，与抗原特异性T细胞的活化表型高度相关（图3h）。另外，作者根据京都基因和基因组百科全书（KEGG）分析得出，N4 Bio+中的上调基因集中在细胞粘附、细胞连接、氨基酸和脂肪酸代谢等途径中（图3i）。总之，作者证明了，PhoXCELL是一种可以在复杂环境中捕获真正抗原特异性T细胞的强大工具，可用于检测原代组织样本中的抗原特异性T细胞。
图4. 通过PhoXCELL对离体TSA反应性T细胞进行检测。
最后，作者尝试从组织样本中捕获肿瘤特异性抗原（TSA）反应性T细胞。作者将获得的皮下实体瘤消化成单细胞悬液，通过密度梯度离心分离后，从肿瘤细胞中富集肿瘤浸润淋巴细胞（TIL）。作者用来自肿瘤裂解物的TSA来引发自体iDC，并将其作为诱饵细胞。通过DC的酶水解和呈递，非突变肽和TSA的相关表位都被装载到iDC表面的MHC上。值得注意的是，经过引发的iDC在共培养时可以识别TSA反应性T细胞并与之相互作用，这促使作者认为TSA反应性T细胞是可以被生物素标记、并通过基于PhoXCELL的抗原特异性T细胞捕获策略进行富集的（图4a）。作者发现，TSA引发的DBF-iDC不仅捕获了自体CD8+ TILs（35.9%），而且还以相似的标记率（29.1%）同时检测到了CD4+ TILs（图4b，c）。相比之下，在未受刺激的DBF-iDC中仅观察到了轻微的背景标记(∼10%），这些背景标记可能是由于细胞表面存在TCR-pMHC以外的、其他配体−受体介导的细胞相互作用。此外，作者在引流淋巴结（dLN）中捕获了TSA反应性T细胞。PhoXCELL在dLN中检测到了低比例的CD8+和CD4+ TSA反应性T细胞（CD8+ T细胞为4%，CD4+ T细胞14.2%，图4b，d），表明存在更少和更低亲和力的TSA反应性T细胞。作者进一步评估了由PhoXCELL鉴定的抗原特异性T细胞的TSA反应性。正如预期的那样，当用经过肿瘤裂解物预处理的iDC进行再刺激时，在Bio-和Bio+两组中，未经预处理的DBF-iDC标记分选出的CD8+ TILs中仅检测到可忽略的IFN-γ分泌水平（图4e，g）。相反，由肿瘤裂解物引发的DBF-iDC标记的CD8+ Bio+TILs可以被再刺激以分泌IFN-γ，而Bio-TILs不能被有效地再刺激（图4e，g）。此外，在CD4+ TILs中也观察到了相同的结果，仅能在由肿瘤裂解物引发的DBF-iDC标记的Bio+TILs上检测到显著的IFN-γ的分泌水平（图4f，g）。最后，作者发现，所有生物素化的CD8+ TILs都是PD-1+和CD39+的（图4h），这与已有报道一致，即PD-1和CD39是CD8+ TILs中表达的潜在新抗原特异性标记物。总之，这些结果证明了，真正的CD8+和CD4+ TSA反应性T细胞可以同时被PhoXCELL捕获和富集。总之，作者在本研究中，建立了一种基于光催化剂的细胞间标记策略，可以识别接近自然状态的抗原特异性T细胞。
文章编号:305
原文链接:
https://pubs.acs.org/doi/10.1021/jacs.2c00159
原文引用: 10.1021/jacs.2c00159
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