分享一篇发表在Nature Communications上的文章，题目为 “Genetically encoding ε-N-methacryllysine into proteins in live cells”，通讯作者是来自浙江大学生命科学研究院的张龙教授和杨兵教授，美国威奇托州立大学的吴海帆老师和浙江大学医学院第二附属医院的吴明医生。

赖氨酸酰化修饰是一类非常重要的蛋白质翻译后修饰，在各种细胞过程中起着关键作用。结合抗体富集、高分辨质谱和生物信息学分析，研究者已经鉴定了上千个赖氨酸酰化修饰位点。但是只有27个赖氨酸甲基丙烯酰化（Kmea）修饰位点在组蛋白中被鉴定到，使用常规的生化方法很难将Kmea修饰物与其结构异构体巴豆酰化（Kcr）分离、纯化和区分。在本文中作者在一种非组蛋白Cyclophillin (CypA)上鉴定到赖氨酸甲基丙烯酰化修饰，并结合遗传密码子扩展技术研究Kmea在CypA中的功能。

在作者前期研究硫氧还蛋白和CypA相互作用的工作中，作者根据open search结果发现在CypA的K125和K131位点出现了疑似甲基丙烯酰化和巴豆酰化的68.023 Da的质量位移。作者使用甲基丙烯酰化抗体进行Western blot实验发现有明显的Kmea信号条带，而将K125和K131位点突变后信号均有减弱，这些数据表明CypA的K125和K131位点都被甲基丙烯酰化。为了进一步验证，作者提出了甲基丙烯酰化多肽形成环状报告离子的碎片化途径并在CypA酶解产生的Kmea肽和人工合成的Kmea肽中均观察到m/z=152.107的环状报告离子。

为了研究Kmea对CypA相互作用蛋白组的影响，作者将非天然氨基酸MeaK插入到CypA的K125位点构建CypA K125MeaK，野生型CypA作为对照，两者均含有免疫沉淀（IP）的链球菌标签。将CypA K125MeaK和WT CypA转染进入HEK293T细胞后进行亲和纯化和label free定量质谱分析，作者鉴定到68个CypA K125MeaK相互作用蛋白，对这些蛋白进行生物学过程分析表明这些蛋白富集在细胞氧化还原稳态通路中。

接下来作者希望寻找CypA Kmea修饰的“eraser”。作者首先通过MeaK插入K85位点的荧光探针EGFP成功证明由基因编码的Kmea可以被内源去酰基化酶识别。为了确定哪种酶是CypA Kmea的“eraser”，作者在CypA K125MeaK IP实验中发现组蛋白去乙酰化酶HDAC1-3与CypA K125MeaK相互作用。作者进行了Co-IP实验来验证CypA K125MeaK和HDAC1-3之间确实存在相互作用。此外，当带有Flag tag的HDAC1与CypA K125MeaK在HEK293T细胞中共表达时，CypA上的Kmea修饰水平下降，然而，当HDAC2或HDAC3共同表达时，没有观察到变化。因此HDAC1被鉴定为一种可以去除CypA中的Kmea修饰的酶。

总而言之作者发现非组蛋白CypA上存在赖氨酸甲基丙烯酰化修饰，结合遗传密码子扩展技术研究Kmea对CypA相互作用蛋白组的影响，同时HDAC1被鉴定为一种可以去除CypA中的Kmea修饰的酶。

本文作者：TZM

责任编辑：LYC

DOI：10.1038/s41467-025-57969-2

原文链接：https://doi.org/10.1038/s41467-025-57969-2