Split-BioID是一种基于BirA*酶的蛋白质片段互补分析方法，可以从空间和时间上分析蛋白质复合体。Split-BioID通过将BirA*分为两个片段，分别连接到两个相互作用的蛋白上，在两个相互作用的蛋白融合在一起时，BirA*可以重新组装恢复活性。在运用该方法时，可以通过实验选择合适的分裂位点，常用的方法有将分裂后的BirA*分别与FKBP12-rapamycin复合物的结合位点（FKBP12-rapamycin binding，FRB）和FK506结合蛋白（FKBP）融合，在加入雷帕霉素后，FRB可以和FKBP相互作用，使BirA*的两个片段重新连接，以此可以验证其生物素化活性的恢复情况。BioID在体内可以给10 nm范围内感兴趣的蛋白标记上生物素，无论其是否产生了相互作用。而Split-BioID只有在两种蛋白质相互作用时，才会在天然细胞环境中被激活，能够在单一和简单的分析中无偏见地检测一对相互作用的蛋白质形成的复合物，因此该方法在PPI分析方法中是独一无二的。De Munter 等运用该方法将BirA*分为两个无活性的部分，分别融合到蛋白质磷酸酶PP1的催化和调节亚基上，用于筛选PP1全酶的底物和其他蛋白相互作用物。

      Contact-ID也是split-BioID的一种，将BirA*分为N-G78（B1）和G79-C（B2）两个片段，并将这两个片段分别与位于ER膜（ERM）的SEC61B氮端（B1-SEC61B）和位于线粒体膜的外膜（OMM）的TOM20碳端（TOM20-B2）融合，生物素化活性依赖于线粒体相关膜（MAM）的形成，用于研究线粒体膜与内质网膜的接触位点的蛋白质组。只有当它们在膜接触位点物理地相互作用和重组时才能恢复生物素化能力。在原位标记两个细胞膜接触点的蛋白质组时，必须满足以下两个条件：（1）Split-BioID系统的生物素化活性仅在两片段邻近后恢复，并可以通过邻近可控的生物系统验证，例如雷帕霉素诱导的蛋白质-蛋白质相互作用；（2）两个分裂片段之间的内在亲和力应忽略不计，以避免人为的MAM形成和随后的假阳性鉴定。该方法专门对定位在MAM上的蛋白质进行生物素化，并通过质谱鉴定生物素化的位点，从而明确揭示了活细胞中的MAM蛋白质组。

    BioID2（231 AA）是来源于A．aeolicus的生物素连接酶R40G突变体，自然缺乏DNA结合结构域的生物素连接酶，比BioID小约三分之一，体积的减小增强了与其融合的蛋白的靶向性和定位性。与BioID相比，BioID2诱导生物素化所需要的生物素浓度更低，所需要的时间更短，这一特性有利于其在难以补充生物素的体系中运用，且BioID2的最适反应温度约50 ℃（BioID最适温度约37 ℃），适用于嗜热菌的标记，当目标蛋白质显著大于BioID2的标记半径或当融合蛋白是较大的蛋白质复合物时，可以通过增加柔性连接链扩大其标记范围。目前也有将BioID2运用在体内的研究，Feng等通过CRISPR-Cas9将BioID2敲入小鼠连接蛋白-2（JPH2）用于识别体内心脏二联体蛋白质组，发现了JPH2的多个突变与人类心肌病的相关性。

      所有的标记蛋白与靶蛋白融合都需要考虑一个问题，即融合蛋白是否会影响靶蛋白的功能与定位。BioID1的大小为35 kD，有研究表明BioID1的存在可能会限制内核膜（INM）蛋白通过核孔复合物（NPC），从而干扰它们的正确靶向，在INM蛋白的核质结构域延伸超过60 ~ 70 kD时，它们进入细胞核的过程就会受到阻碍。即使是天然缺失DNA结合结构域的BioID2的大小也达到了26.6 kD，对于许多INM蛋白来说，BioID2仍然会影响其在内核膜的分选和定位。

     为了解决这个问题，Chojnowski等开发了新的方法——双组分BioID（2C-BioID），该方法将生物素连接酶与靶蛋白分别表达，但在生物素连接酶上融合了FKBP，在靶蛋白上融合了FRB，在加入无生物活性的雷帕霉素模拟物AP21967后，AP21967可以利用FKBP-FRB二聚系统将FKBP：FRB低聚化，以达到将生物素连接酶与内核膜蛋白连接且不影响其定位的效果。以INM蛋白层相关多肽2β（LAP2β）为例，LAP2β的核质结构域的大小约46 kD，由于大小的限制，将BioID1或BioID2连接到LAP2βN末端可能会限制融合蛋白进入INM。将FKBP与BioID2融合，将FRB与LAP2b的N端融合，FRB结构域为11.2 kD，因此，FRB结构不会影响LAP2β在INM上的定位。2C-BioID的设计确保了生物素连接酶与感兴趣蛋白的结合只发生在加入AP21967之后，加入AP21967之前的体系可以作为对照，排除非特异性结合。因此，与传统的BioID相比2C-BioID改善了融合蛋白的靶向问题，并减小了假阳性的可能，增强了生物素连接酶标记的特异性。

     TurboID和miniTurbo是由Branon等以R118S突变的BirA通过出错率高的PCR产生并通过将其表达在酵母表面而筛选出来的，它们的催化效率比BirA的更高，在添加生物素10 min内即可起到邻近标记的作用。TurboID的大小也为35 kD，相较于野生型的BirA具有15个突变；miniTurbo的大小为28 kD，缺少N末端结构，相较于野生型BirA有13个突变。虽然miniTurbo的生物素化活性比TurboID低，但在添加外源生物素之前，其标记较少，背景干净，在需要精确控制标记时间的实验中miniTurbo是一个更好的选择。在HEK 293T细胞的细胞核、线粒体基质、内质网内腔和内质网膜这4个细胞结构中，TurboID的邻近标记效果均优于miniTurbo，且稳定性更强，另外TurboID也可用于果蝇和蠕虫的体内邻近标记。

     Split-TurboID与split-BioID相似，通过将TurboID分成有较高重组能力的两个非活性片段并将其分别与FRB-FKBP连接，再将其分别与不同亚细胞区室表达的蛋白融合，建立了生物素和雷帕霉素依赖性的表达体系，研究了内质网-线粒体接触位点的蛋白质组成。当蛋白-蛋白相互作用时或膜-膜接触时，TurboID的两个组分重组被激活，达到邻近标记的作用。

      May等建立了稳定表达BioID和TurboID融合蛋白的细胞系，并通过免疫印迹、免疫荧光和基于生物素亲和纯化的蛋白质组学对两者进行了对比。发现TurboID存在蛋白质不稳定的迹象，在没有外源生物素的情况下也可以进行持续的生物素化，实际标记半径也有所增加。不过，在内质网腔中TurboID的生物素化较BioID作用更强。

     AirID在2020年被首次报道，是Kido等从自己建立的文库（由Blastp Web服务器和自定义Python脚本建立的一个和E．coli BirA有30%同源性的文库）中筛选得到，是在原始BirA的基础上设计的新型生物素标记酶。BirA*的近端生物素化活性明显低于TurboID和AirID，AirID标记时较TurboID需要的生物素量低（TurboID需要50 μmol/L生物素，而AirID在5 μmol/L生物素甚至不含生物素的体系中也能达到邻近标记的目的），且AirID的生物素化发生在邻近的赖氨酸残基上，并且没有特殊的序列优先性，生物素化准确性高还可用于检测药物对PPI的抑制作用。