给大家分享的是2022年发表在analytical chemistry题为“Deciphering the Interactome of Histone Marks in Living Cells via Genetic Code Expansion Combined with Proximity Labeling”的文章。

  破解组蛋白翻译后修饰的内源性相互作用对于理解表观遗传调控的机制至关重要。然而，大多数确定组蛋白PTM相互作用的分析方法是在体外进行的，缺少对体内原生染色质的研究。赖氨酸巴豆酰化Kcr被认为是调节基因转录的重要组蛋白翻译后修饰，但Kcr的互作仍需探索。本文作者提出了一个通用的方法，通过遗传密码拓展技术、APEX2邻近标记和定量蛋白质组学，在活细胞中对所选的组蛋白翻译后修饰的互作进行分析。作者将APEX2与重组组蛋白H3的Kcr插入位点进行了基因融合，生成了APEX2-H3K9cr来插入原生染色质。激活后，APEX2触发了H3K9cr互作的体内生物素标记，然后可以用链霉素珠富集并通过质谱鉴定。蛋白组学分析进一步揭示了H3K9cr的内源性互作，并且证明了该方法的可靠性。作者同时用这种方法，确定了DPF2为H3K9cr的候选相互作用物。该项研究为识别活细胞中的组蛋白的互作提供了一个新的策略。

实验内容

1、绘制体内组蛋白PTM互作组的新策略

  作者开发了一种方法，使用位点特异性遗传密码扩展技术结合APEX2邻近标记技术，通过定量蛋白质组学解读活细胞中组蛋白翻译后修饰的互作。

  以组蛋白H3Kcr为范本，利用正交的氨基酸-tRNA合成酶和tRNA对，将Kcr插入到重组组蛋白H3上，从而在H3上特定的位点产生Kcr修饰。同时，该H3突变体被融合到工程化的APEX2上，构建成H3K9cr-APEX2并将其插入活细胞组蛋白上，然后进行自由扩散并与H3K9cr的互作蛋白结合。再通过加入生物素苯酚BP和过氧化氢后，APEX2催化生成限制性和高活性的生物素酚基自由基，与邻近的互作蛋白共价结合。然后通过基于定量蛋白质组，对生物素化的蛋白进行富集和表征（Fig. 1）。

Figure 1

2、Kcr在天然染色质中组蛋白的定点插入

  为了测试Kcr整合到蛋白质中的可行性和效率，首先利用KcrRS-tRNA对在293T细胞中表达了带有Tyr151TAG突变的绿色荧光蛋白GFP。荧光显微镜分析结果表明，只有同时存在Kcr和KcrRS的情况下，才能观察到绿色荧光。验证了Kcr可以定点插入到GFP中，并且以较高的产率获得了全长蛋白。

  接下来，作者将构建好的带有FLAG标签和Lys9TAG突变的组蛋白H3，与KcrRS基因一起共转染到293T细胞，形成H3K9cr（Fig. 2a）。在RS和Kcr都存在的情况下，可以观察到与FLAG-H3K9cr相对应的条带（Fig. 2b）。此外，采用免疫共沉淀法捕获带有FLAG标签的H3和H3K9cr，并用H3K9cr抗体检测（Fig. 2c）。该结果的分析表明，相比于H3，Kcr可以更有效地定点插入H3K9cr。

  作者接着通过细胞分级和免疫荧光分析来进一步研究修饰后的组蛋白的定位。WB结果显示，H3Kcr主要与染色质结合，而不是游离的（Fig. 2d）。此外，将GFP融合到H3K9cr的C末端，来显示其细胞分布。结果表明，H3K9cr-GFP的信号与DAPI染色的核DNA信号重叠，进一步证实了其主要定位于细胞核（Fig. 2e）。以上结果表明，重组H3K9cr存在于染色质中。

Figure 2

3、活细胞中组蛋白结合子的高效标记与鉴定

  基于APEX2的邻近标记技术已经成为在活细胞中捕获诱饵蛋白的相互作用的一种强有力的方法。作者首先探究了这个方法能否应用于组蛋白结合子的研究上。作者构建了APEX2-NLS（核定位序列），并证实其可以催化核内蛋白质的生物素化（Fig. 3b）。继而将APEX2在N端与H3融合，表达出APEX2-H3，使互作蛋白能够与H3生物素化（Fig. 3a）。然后质谱鉴定标记的蛋白质，包括已知的组蛋白互作如NASP和ANP32A，从而验证了该方法。

  同时，作者还构建了H3-APEX2的融合体，将APEX2连接到H3的C末端，来标记H3的互作，获得了与APEX2-H3相似的结果（Fig. 3b）。考虑到组蛋白的N末端是灵活的、无结构的和PTM修饰的，APEX2-H3使APEX2与N末端相邻，可能更有助于hPTM结合的标记。因此作者选择将APEX2设置在H3的N末端，用于后续实验。最后，还进行了免疫荧光分析，证实了APEX2-H3定位于细胞核中，并与生物素化蛋白重叠（Fig. 3c）。

Figure 3

4、体内H3K9cr相互作用的定量蛋白质组图谱的构建

  在验证了Kcr和APEX2邻近标记的插入后，作者接下来使用该策略对H3K9cr的相互作用进行了蛋白质组学分析。为了降低假阳性，作者设计了对照实验，将未经Kcr处理的（-Kcr）和转染APEX2-H3的细胞作为对照（Fig. 4a）。WB结果表明，在Kcr存在的情况下产生了全长的APEX2-H3K9cr，而在缺失Kcr的情况下，没有观察到明显的条带（Fig. 4b）。相反，APEX2-H3（1-8）片段在有或无Kcr的情况下都被检测到，意味着产生了截短的产物。因此设置了一个对照组，来推断被APEX2-H3（1-8）片段捕获的蛋白质（Fig. 4a）。同时，为了排除H3的互作，作者还设置了另一个对照组，用APEX2-H3转染细胞（Fig. 4a）。作者认为，当一个蛋白质在（+Kcr/-Kcr）和（H3K9cr/H3）实验中都拥有高比率和统计学意义时，那这个蛋白就是H3K9cr的高置信度相互作用者（Fig. 4a）。

  作者进行了全蛋白质组的分析。在两组定量蛋白质组的结果中，146种蛋白被认为是候选的结合蛋白。结果确定了几种与甲基化相关的酶，如PRMT1，表明它们可能通过非催化结构域与H3K9cr相互作用。

  接下来作者对这些蛋白进行了GO分析，结果表明大多数蛋白富集于在染色质/RNA结合、转录调控和组蛋白结合方面（Fig. 4d）。

Figure 4

作者将APEX2邻近标记技术与遗传密码扩展技术结合，利用定量蛋白质组学，在活细胞中对H3K9cr的互作进行了分析，验证了该方法的可靠性，并利用此方法，筛选出DPF2为H3K9cr的候选相互作用物。该项研究为识别活细胞中的组蛋白翻译后修饰的互作提供了一个新的策略。

撰写人：余思琴

原文链接：https://doi.org/10.1021/acs.analchem.2c01042