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首先，胆碱是哺乳动物细胞必需的营养物质，目前人们对胆碱及其代谢物在细胞功能方面的理解还十分有限。除了其基本的对细胞膜的作用外，胆碱也与癌症密切相关，生物体内高水平的胆碱代谢物正是癌症的标志之一。因此，鉴定与胆碱代谢物相互作用的蛋白质组并对这些蛋白质功能进行表征是揭示胆碱代谢物的生物功能至关重要的一步，而小分子探针正是实现这一目的的优良工具。
设计理念。在生物体中，胆碱会经过肯尼迪途径，从胆碱逐渐代谢成为磷酸胆碱，5’-二磷酸胆碱（CDP胆碱），磷脂酰胆碱（PC）以及鞘磷脂（SM）。在作者的设计中，胆碱分子通过化学修饰，连接上炔基以及二氮丙啶，这种化学修饰并不妨碍胆碱的自然代谢过程，因此通过自然代谢途径可以得到各种胆碱类似物的具有光交联性的可点击代谢产物。胆碱类似物探针在光照下可以与各自结合的蛋白发生共价交联，而后pull down，富集，进行蛋白质组学分析，获取结合蛋白质组数据。因此带有二氮丙啶以及炔基的胆碱类似物可以正常进行代谢是该方法得以实现的重要先决条件。
图1. a、哺乳动物细胞中的胆碱代谢。b、利用胆碱类似物探针获取哺乳动物细胞中胆碱代谢物相互作用蛋白质组的策略。
不同胆碱类似物探针的代谢标记能力评估。为了确定最合理的胆碱类似物探针结构，作者首先合成了多种不同结构的带炔基或叠氮的胆碱类似物探针，对其代谢能力进行评估。其中作者主要合成了九种探针，并且分别进行了LC-MS/MS（前体离子扫描PIS模式下），提取离子色谱图（XIS）以及点击荧光标记对其结合与代谢能力进行评估。其中值得注意的是九种胆碱类似物都成功标记了相互结合蛋白，即使是结构与胆碱自身差异极大的类似物7也有一定的结合能力。这从一定程度上说明了对胆碱N原子上取代基的修饰对其代谢影响较小。另一方面，从点击荧光标记中的荧光强度来看，对同种类似物的同系物，取代基碳链越长其标记能力越低，而使用较短的取代基对N进行多取代则不会产生较大的荧光强度的差别。因此作者确定了胆碱类似物探针应当在不同取代基上分别连接上二氮丙啶以及炔基，从而达到取代基碳链较短，获得更好的蛋白结合能力的目的。同样各种不同的胆碱类似物探针都一定程度上实现了代谢标记，表明了其策略的可行性。
图2. 9种不同胆碱类似物探针的代谢标记表征。自左至右分别为胆碱类似物结构，LC-MS/MS（前体离子扫描PIS模式下）谱图，提取离子色谱图（取丰度最高的三种脂质），只加入胆碱类似物的点击荧光标记图以及加入胆碱与胆碱类似物进行竞争的点击荧光标记图。
意外发现了一种胆碱头基重塑途径。确定了胆碱类似物探针的最优结构后，作者设计了含有二氮丙啶以及同时含有二氮丙啶与炔基的类似物10和11进行代谢标记。对其代谢后的LC-MS/MS以及提取离子色谱分析确定两种胆碱类似物都成功实现了代谢标记，但令人感到意外的是在胶内荧光实验中，利用点击化学使用叠氮化物染料对标记了代谢了类似物11的细胞裂解液进行荧光标记，得到的荧光标记蛋白强度几乎可以忽略不记。经过对类似物11的1H NMR分析以及紫外光谱实验，作者确定这一结果并非来源于探针缺乏紫外反应性以及探针自身不稳定。通过细胞成像分析，作者发现虽然类似物11与类似物7，8，9产生的提取离子色谱图峰强度相似，但是类似物11的细胞成像实验结果与类似物7，8，9并不相似，而是与代谢物1更为接近。因此作者提出类似物11可能转化为了类似物1，再进行标记的假设，而这一转化需要经历Cα-Cβ键断裂。同样的，类似物11也可能通过Cα-Cβ键断裂产生类似物10，进行代谢标记。大量类似物11转化为类似物1和10，少量类似物11未发生改变，这也许可以解释细胞成像实验产生较强光强而胶内荧光强度低这一现象。为了验证这一观点，作者又设计了类似物12与类似物13进行代谢标记分析。其中类似物13在类似物11的基础上于α位多了一个甲基，为支链类似物。若与作者的假设符合，则最后应发生Cα-Cβ键断裂，产生类似物14。但对LC-MS/MS结果中磷酸化类似物14的检测却显示没有类似物14的产生，相反，有大量的磷酸化类似物1产生。这表明类似物13经过代谢并未产生类似物14，而是依然产生了类似物1.因此胆碱头基重塑途径很可能并非Cα-Cβ键断裂，而是C-N键断裂后再进行一步甲基化。为了验证这一新的猜想，作者使用全氘代胆碱进行代谢实验，若假设成立，则LC-MS/MS应检测出类似物16的峰，而实验结果与这一设想相符合。因此，作者发现了一种新的胆碱头基重塑机制，即胆碱头基在生物体内会经过C-N键的断裂脱烷基化而后进行甲基化的过程。
图3. a、类似物10的代谢标记分析。b、类似物11的代谢标记分析以及胶内荧光。c、类似物11的细胞成像以及对其中类似物1含量的分析与类似物11转化为类似物1的可能机理。d、对类似物11代谢标记的细胞中类似物10含量的分析以及类似物11转化为类似物10的可能机理。e、类似物12的代谢标记分析。f、类似物13转化为类似物14的可能途径以及对类似物14与类似物1的含量分析与类似物13转化为类似物1的可能机理。g、类似物15转化为类似物16的可能机理以及类似物15代谢的细胞中类似物16的含量分析。
确定用于蛋白质组学分析的探针结构。由于胆碱头部存在重塑机制，因此需要重新设计探针。此处作者设计了更长链取代的胆碱类似物17和18，经过代谢标记分析发现两者都可以成功地进行代谢标记。同时对含有二氮丙啶的类似物18代谢结果的LC-MS/MS检测表明只有很少部分的类似物18转化为了类似物1或类似物17，其含量之低几乎可以忽略不记。同时对HEK293，HeLa，MDA-MB-231三种不同细胞系进行代谢其结果基本一致，表明类似物18不会形成大量类似物1和类似物17。因此胆碱类似物18是一种理想的具有光交联性质的可点击荧光探针。
图4. a、类似物17的代谢标记分析。b、类似物18的代谢标记分析。c、类似物18转化为类似物1的可能途径与类似物18代谢标记的细胞中类似物1的含量检测。d、类似物18转化为类似物17的可能途径与类似物18标记的细胞中类似物17的含量检测。e-f、使用类似物18对HEK293，HeLa，MDA-MB-231三种细胞系进行代谢标记后类似物1，18，17的相对丰度。
获取哺乳动物胆碱代谢物相互作用蛋白质组。利用胆碱类似物18作为胆碱探针，通过胶内荧光分析，发现该探针标记蛋白量呈现浓度依赖性以及UV照射时间依赖性。而其他几种含二氮丙啶以及炔基的胆碱类似物11，12，13均未产生荧光，表明未能成功标记蛋白。在确定了最佳的代谢标记，光交联，以及生物素化条件后，使用探针对细胞进行孵育，而后光照交联，加入Biotin-N3进行点击结合后对蛋白进行富集，得到胆碱代谢物相互作用蛋白质组。而后通过蛋白质组实验，于捕获到的902种蛋白质中获取了674种高p值，高富集程度的高致信蛋白。并且通过对七种已知胆碱结合蛋白的western blot实验确定了该方法具有较高的准确性。最终得到了高致信的胆碱代谢物相互作用蛋白质组学数据，并通过蛋白数据库大致确定了蛋白的分布即功能。从结果来看，有67%的蛋白质与多种疾病相关，且有部分蛋白质是已知的抗癌药物靶标。这对人们研究胆碱及相关疾病有不小的帮助。
图5. a、使用不同浓度胆碱类似物18作为探针对HEK293细胞进行代谢标记的胶内荧光。b、使用胆碱类似物18作为探针在不同UV照射时间下对HEK293细胞进行代谢标记的胶内荧光。c、使用胆碱类似物1，11，12，13，18和S26对细胞进行代谢标记的胶内荧光比较。d、类似物18代谢标记的细胞中获得的生物素化UV交联蛋白的抗生物素蛋白浓度依赖性富集western blot。e、捕获到的902种蛋白的p值，富集率二维分布图。f、对已知的七种胆碱结合蛋白的一级抗体western blot印迹。g、根据UniProt数据库获得的蛋白亚细胞分布。h、根据PANTHER数据库得到的蛋白生化功能分类。i、根据UniProt数据库得到的蛋白中的酶分类。j、根据DAVID数据库得到的蛋白与各类疾病的联系。k、根据DrugBank数据库得到的可作为药物靶点的蛋白分类。
磷酸胆碱对调节p32蛋白与其相互作用物结合能力的重要作用。为了研究蛋白质-胆碱代谢物相互作用对蛋白质功能的影响，作者选择了在蛋白质组学分析中富集程度最高的p32蛋白进行研究。p32蛋白是一种在不同细胞位置表达，执行多种功能的，在许多生理过程和疾病中发挥重要作用的蛋白，且有许多物质均可与p32蛋白进行结合从而实现不同的生理和病理学功能。同时p32蛋白与其他物质的结合也与癌症相关，因此细胞表面p32蛋白也是一种有前景的诊断标记物和药物靶点。通过对生物素化的重组p32进行ELISA，发现磷酸胆碱可以以竞争方式显著的抑制p32蛋白与HA，Lyp-1，乙酰化Tat肽，以及MCP1的结合。而其他几种胆碱代谢物则几乎不起到抑制作用或者抑制作用很小。这一结果表明了磷酸胆碱对p32蛋白与其他物质结合起到很好的抑制作用，可以作为p32的特异性抑制剂进行使用。
图5. 胆碱代谢物对p32与其相互作用物的结合能力的影响。胆碱代谢物对p32与a、HA .b、Lyp-1. c、乙酰化Tat肽以及d、MCP1结合的ELISA表征。
总之，本文中作者不仅成功获取了胆碱代谢物相互作用蛋白质组学数据，并利用其确定了胆碱代谢物与蛋白的相互作用对蛋白质功能调节的重要性。同时胆碱探针还出乎意料的发现了一种新的胆碱头基重塑机制，为胆碱脂质生物学提供了新的见解。
文章作者：QJL
原文引用：10.1021/acschembio.2c00400
责任编辑：HBQ
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