自然界利用酶对蛋白质特定位点进行翻译后修饰，增加了蛋白质组的功能多样性，而化学家们也开发了一系列用于蛋白质特定位点修饰的化学反应，适用于标准氨基酸或非天然氨基酸 (Uaas)。对蛋白质天然氨基酸残基修饰最有效的化学方法是利用亲电试剂或氧化还原试剂与蛋白质亲核基团的反应，例如赖氨酸的ε-胺、半胱氨酸的硫醇、酪氨酸的羟基或甲硫氨酸的硫醚等。然而直接使用亲电试剂对蛋白进行修饰通常具有挑战性，因为蛋白质的亲电基团在生理条件下不易反应。对于非天然氨基酸，通常使其带有酮、叠氮、烯烃或炔烃等基团，但这些基团在生理条件下反应速率较慢。

近期，加利福尼亚大学王磊教授在J. Am. Chem. Soc. 期刊上发表了题为“Genetically Encoded Quinone Methides Enabling Rapid, Site-Specific, and Photocontrolled Protein Modification with Amine Reagents”的研究论文。本文中，作者在蛋白质中引入两个带有光控基团的非天然氨基酸FnbY和FmnbY，光激活后光控基团脱去在蛋白质原位形成醌甲基化物(QM)，并通过Michael加成反应与胺化物结合。该策略具有良好的生物相容性和较快的反应速率。

图1. 胺衍生物与醌甲基衍生物(QM)进行蛋白质标记的机制。带有光控基团(间硝基苄基)的FnbY或FmnbY通过遗传编码整合到蛋白质中，光激活后在蛋白质原位生成具有高反应性的p-QM或o-QM并与胺衍生物快速发生Michael加成反应。

图2. FnbY或FmnbY通过遗传编码整合到蛋白质。(a、b) 存在或不存在1 mM FnbY或FmnbY时，使用tRNA^Pyl / poQMRS对大肠杆菌MBP-Z (24TAG)基因进行表达，通过SDS-GAGE分析结果表明FnbY或FmnbY成功掺入MBP-Z。 (c) 使用tRNA^Pyl / poQMRS对含有TAG密码子的泛素 (Ub)基因进行表达，SDS-PAGE分析结果表明FnbY或FmnbY成功整合到Ub。 (d) Ub (6FnbY)的ESI-MS谱图。预期值为9575.8 Da，实测值为9575.1 Da。 (e) Ub (6FmnbY)的ESI-MS谱图。预期值为9589.8 Da，实测值为9590.1 Da。

图3. 具有不同功能的胺衍生物的快速蛋白标记。 (a) 快速标记过程示意图。(b-d) 含有炔丙基胺、3-叠氮基-1-丙胺或烯丙胺的Ub (6FnbY)的质谱。其中，9440 Da处的峰表明光激活后FnbY的部分水解，9422 Da处的峰对应于光激活后F损失。 (e-h) 含有炔丙基胺、3-叠氮基-1-丙胺、烯丙胺或4-氨基苯磺酰氟的Ub (6FmnbY)的质谱。结果表明，可通过FnbY / FmnbY将不同功能的官能团缀合到蛋白质上。

图4. (a-c) 将荧光胺衍生物Cy-3引入MBP-Z。蛋白MBP-Z (WT、24FnbY、24FmnbY)与Cy3-胺共同孵育并使用紫外激活，SDS-PAGE及荧光结果表明，只有被光激活的MBP-Z (24FnbY、24FmnbY)能检测到Cy3的荧光。 (d-f) 蛋白MBP-Z (WT、24FnbY、24FmnbY)与生物素-(PEG)₂-胺共同孵育并使用紫外激活，SDS-PAGE及免疫印迹结果表明，只有被光激活的MBP-Z (24FnbY、24FmnbY)能观察到印迹。 (g) 不添加亲核试剂时，MBP-Z (24FnbY)在水溶液中光激活后的质谱。9439.1 Da处的峰代表光激活后的水解产物，9442.0 Da代表F损失。 (h) MBP-Z (24FnbY)与生物素-(PEG)₂结合后产物的质谱，预期值为9795.2 Da，实测值为9794.1 Da，标记效率达到85%。 (i) Ub (6FnbY)与生物素-(PEG)₂结合后产物的质谱，预期值为9809.2 Da，实测值为9809.3 Da，标记效率达到95%。 (j) 将FmnbY掺入大肠杆菌的外膜蛋白eCPX与0.1 mM Alexa Fluor 488酰肼共同孵育并进行光激活，细胞成像结果说明成功标记了大肠杆菌细胞表面含FmnbY的蛋白质。 (k) Ub (6FmnbY)与D-半乳糖结合后的质谱。预期值为9613.9 Da，实测值为9613.7 Da。9452.5 Da处的峰对应于光激活后FmnbY的水解。 (l) Ub (6FmnbY)与D-葡萄糖结合后的质谱。没有观察到与预期值9614.9 Da接近的峰，9434.0 Da处的峰对应于F损失。 (m) Ub (6FmnbY)与1-硫代-β-D-葡萄糖结合后的质谱。预期值为9630.9 Da，实测值为9630.8 Da。 (n) Ub (6FmnbY)与DM1结合后的质谱。预期值为10173.0 Da，实测值为10171.9 Da。

图5. 光照强度和温度对胺与QM之间反应的影响。 (a) 使用365 nm功率为1.5 mW/cm²的紫外灯激活后，对MBP-Z (24FnbY)与10 mM生物素-(PEG)₂-胺结合产物进行蛋白质印迹分析。2 min就能检测到清晰条带，10 min反应达到饱和。 (b) 365 nm功率为5.3 mW/cm²的紫外灯激活后，对MBP-Z (24FmnbY)与1mM生物素酰肼结合产物进行蛋白质印迹分析，10 s就能检测到清晰条带。 (c) 质谱表征使用高功率紫外灯激活1 s、10 s、30 s、60 s时1mM生物素酰肼对Ub (FmnbY)的标记产物。结果表明1 s内已标记36%的Ub (FmnbY)。 (d) 不同温度下，MBP-Z (24FnbY)与3 mM Cy3-胺结合的SDS-PAGE及荧光分析，用低功率紫外灯激活10 min。 (e) MBP-Z (24FmnbY)与5 mM生物素酰肼在不同温度下的蛋白质印迹分析，用高功率紫外灯激活30 s。(f) 高功率紫外灯激活30 s时，0 ℃、4 ℃、25 ℃下，生物素酰肼与Ub (6FmnbY)产物质谱分析。 (g) 生物素酰肼与Ub (6FmnbY)在0 ℃ 下低功率紫外灯激活不同时间的质谱分析。 (h)相同条件下，0 ℃与4 ℃标记效率的比较，结果表明0 °C和4 °C之间无显着差异。

图6. 通过FnbY展示特定位点的自旋标记。 (a) 4-氨基-TEMPO对带有FnbY蛋白的标记。 (b) T4 溶菌酶带状图 (PDB：3LZM)，图中Ile-9和Val-131位点掺入FnbY。 (c) 4-氨基-TEMPO的CW-EPR光谱。 (d) 4-氨基-TEMPO 标记9和131位点带有FnbY的T4L的CW-EPR光谱。 (e) 经背景校正的双自旋标记的T4溶菌酶的偶极函数。 (f) 双自旋标记的T4L自旋间距离分布。 (g) 位点9或131处有自旋标记的T4L与未标记的T4L归一化后的自旋间距离分布比较。 (h-i) 晶体结构显示4-氨基-TEMPO结合在β-碳上，证明其与QM经Michael加成反应结合。

本文提出了一种直接使用弱亲电胺试剂进行蛋白修饰的通用方法。基于FnbY / FmnbY的遗传编码具有以下优点：(1) 可确保修饰位点的特异性以及与各种蛋白质的相容性，不需要特定的化学成分或反应条件； (2) 具有快速反应动力学，反应通常在10 s内完成，这对于标记低丰度蛋白质和具有高时间分辨率的脉冲追踪动态蛋白质变化具有重要意义； (3)胺衍生的功能分子来源广泛且易于合成； (4) 在低温(0和4°C)下同样能够完成标记，这有利于保存纯化后在室温下不稳定的蛋白质； (5) 标记部分很小从而降低对靶蛋白及生物过程的干扰

王磊，加利福尼亚大学旧金山分校药物化学系和心血管研究所教授

1997-2002年，加州大学伯克利分校获博士学位

1994-1997年，北京大学获硕士学位

1989-1994年，北京大学获学士学位

课题组主页：https://pharm.ucsf.edu/wang

https://pubs.acs.org/doi/10.1021/jacs.0c06820