与大家分享一篇发表在JACS上的文章，题目为Cross-Chiral, RNA-Catalyzed Exponential Amplification of RNA。文章的通讯作者为Gerald F. Joyce教授，来自索尔克生物研究所，目前Gerald F. Joyce教授课题组正致力于利用体外进化尝试在试管中重建早期生命的生物分子，并诱导RNA的构建模块进行组装、复制和进化。 
生物学中一个公认的事实是，聚合酶和被扩增的DNA或RNA通常具有生物学上的惯用手性，即蛋白质由L-氨基酸组成，核酸由D-核苷酸组成。并且已有报道证明，如果镜像关系被反转，由D-氨基酸组成的聚合酶蛋白可以合成甚至扩增由L-核苷酸组成的核酸。那么，有可能使用生物手性的聚合酶来扩增非生物手性的核酸吗？ 针对这一问题，目前已有关于一个具有L型RNA聚合酶活性的D型核酶的报道，这一核酶可以催化相反手性RNA分子的合成。最近，该交叉手性聚合酶经过优化，实现了在聚合的位点接受具有所有可能序列组合的5'-三磷酸化的单体或寡核苷酸底物。以此为基础，在本研究中，作者使用经过优化的交叉手性聚合酶“27.3t”（图1a，b），对相反手性的RNA进行了指数扩增，产生L-锤头核酶，并证明这一产物对L-RNA底物具有预期的位点特异性切割活性。 
图1. 交叉手性聚合酶和锤头核酶的组成。 锤头核酶是研究的最好的具有催化作用的RNA之一，其最小催化基序由三个茎组成，这些茎由三个短单链区域连接（图1c）。其中一个单链区域包括用于定义切割位点的单个核苷酸。另一个单链区域由三个嘌呤核苷酸组成，形成通用碱以协助催化。第三个单链区域由七个高度保守的核苷酸组成，其中包括一个关键的鸟苷酸残基，起到通用酸的作用。锤头核酶催化的RNA切割的一种常见形式是将上述七个高度保守的核苷酸区域作为起催化作用的酶区域，两侧形成两组与RNA底物形成Watson-Crick配对的结合臂区域（图1c）。本文中就选择了这种形式，锤头核酶序列（正链）及其互补链（负链）各被分成三组寡核苷酸（黑点所示），利用交叉手性聚合酶核酶催化的四个连接反应，在指数扩增过程中合成两条链（图1d）。 作者使用过量的D-交叉手性聚合酶核酶、起始量为0.1 nM的完整负链L-RNA模板、各1 μM的两种荧光标记的L-寡核苷酸以及各0.5 μM的四种未标记的L-寡核苷酸来启动热循环PCR反应。由于与蛋白质聚合酶相比，由RNA构成的聚合酶的催化速率较慢，因此作者将每个循环的延伸时间设置为4小时，在10 °C下进行。变性步骤为在64 °C下进行2秒，升温速率为1.5 °C/秒。 经过24轮热循环后，相比于荧光标记的5'-寡核苷酸引物的起始量，荧光标记的全长正链产物的产率为2.0%（图2a，b），在相同的反应混合物中，全长负链产物的产率为2.7%。相对地，未经热循环而仅在10 °C下孵育相同时间的对照反应中未检测到任何产物的产生。此外，交叉手性RNA扩增反应具有手性选择性，当D-聚合酶核酶在具有L-和D-寡核苷酸底物的混合物中反应时，产量与单独使用L-底物所获得的相当，且没有可检测的D-RNA产物产量（图2c）。 作者接下来用这种方法制备了锤头核酶的正链产物，测试其切割相应的L-RNA底物的能力。作者使用3'-带有生物素修饰的正链的末端寡核苷酸底物，经过上述的热循环过程后，用链霉亲和素包被的珠子来分离和回收正链。作者在存在或不存在起始量为1 nM的负链L-RNA模板的情况下，在80 μL体积中进行了18个热循环的扩增。作者将回收的产物与相应的L-RNA底物孵育24小时后，分别有14%（有1 nM的负链L-RNA模板）或0.8%（没有负链L-RNA模板）的L-RNA底物被切割（图3）。同时，使用通过固相合成制备的200 nM L-锤头核酶的阳性对照反应，在相同条件下产生了82%的切割，而在没有锤头核酶的情况下未检测到切割产物的出现。经过测试作者发现，扩增产物的比活性与化学合成的L-锤头核酶的比活性相当。 为了确定扩增反应是否是指数级的，作者改变了负链L-RNA模板的起始量，并测量了新形成的正链和负链L-RNA产物的产量与热循环次数的函数。作者对每条链的5'组分进行了不同标记，从而实现对来自共同反应混合物的两种产物进行定量。经过测量和分析，RNA拷贝数与循环数的半对数图对于两种测量产物都是线性的，与指数增长一致（图4a）。该图的斜率对应于log(1+f)，其中f是每个循环的产物的产率分数。对于正链和负链，f的计算值分别为0.21 (r2=0.97)和0.26 (r2=0.98)。因此，共需要4-5个热循环来实现放大模板的两倍。 另外，正如在标准PCR中一样，研究者可以通过实验测量达到扩增阈值水平（Ct值）所需的热循环次数，它与模板的起始浓度呈对数线性关系。因此根据观察到的Ct值，这些数据也可用于计算未知样品中模板的起始浓度。作者选择2 nM产物浓度这一阈值，并测量起始浓度范围在0.1-0.6 nM的负链L-RNA模板的Ct值，发现具有良好的对数线性（图4b；r2 = 0.90）。这些结果进一步证明，RNA催化的交叉手性扩增确实是指数级的。
通过“菌落PCR”或“乳液PCR”实现对单个PCR扩增子的空间分离为许多重要技术提供了基础，例如下一代DNA测序和对DNA编码文库的高通量筛选。作者因此将乳液PCR应用于交叉手性聚合酶核酶催化的扩增反应，其中单个液滴的平均直径为7.1±1.5 μm（图5a）。每个液滴平均含有11个负链L-RNA种子分子，以及指数扩增所需的D-核酶和L-寡核苷酸底物。作者发现，悬浮在油相中的水滴在热循环条件下可以在数天内保持稳定，且基于乳液的扩增产物与在溶液相反应中获得的产物没有显著差异（图5b、c）。
总之，作者在本研究中，利用优化的具有交叉手性RNA聚合酶活性的核酶，通过指数扩增获得了L构型的锤头核酶，并验证其具有对L-RNA底物的位点特异性切割活性。 https://pubs.acs.org/doi/10.1021/jacs.1c09233.
原文引用：10.1021/jacs.1c09233.
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