今天推荐一篇发表在Angew Chem.的文章，通讯作者是来自日本理化研究所的YoshihiroShimizu教授和名古屋大学Hiroshi Abe教授。他们的研究方向分别是无细胞蛋白质合成和对RNA的分子设计，以进行新的生物医学技术的研究。

mRNA疗法是一种新兴的疾病治疗方法，目前的主要应用方向为疫苗和蛋白质替代疗法（protein replacement therapy）。mRNA是由DNA在细胞核中转录，然后穿过核膜，在细胞质中与核糖体结合，指导蛋白质合成的一类单链核糖核酸。mRNA本身不具有治疗作用。经化学修饰的外源mRNA必须穿过细胞膜，在细胞内稳定存在，才能翻译出行使治疗功能的蛋白。因此，mRNA的修饰方法对于改善mRNA性质具有特别重要的意义。

用硫代磷酸（phosphorothioate，PS）取代核酸中的磷酸作为链接，即S原子取代磷酸基团中非桥连O原子，产生的核酸类似物具有改善的生物稳定性和细胞膜渗透性。本文中作者研究了用PS修饰的mRNA在无细胞体系中的蛋白质翻译情况。实验中，作者用PS修饰的核苷三磷酸（NTP磷酸，PS isintroduced at the α-position of thetriphosphate）替代转录反应中的NTP，通过T7 RNA聚合酶转录，可制备较长的PS修饰的mRNA。虽然酶法制备PS修饰的mRNA(PS-mRNA)的方法已经被开发出来，但PS很少用于mRNA。有报道显示，与相应的未修饰mRNA（POmRNA）相比，用一种NTP，用 制备的PS-mRNA，通过大肠杆菌无细胞翻译系统合成蛋白质的效率提高了两倍。然而，若mRNA全被PS修饰，蛋白质产量只有POmRNA的30%。在本文中，作者利用PUREsystem对PS-mRNA翻译进行了重新研究（图1）。

作者以FLAG-EGF编码序列作为mRNA模型（图2a），其中含有核糖体结合位点，编码FLAG三段重复序列和编码表皮生长因子序列。首先，作者以dsDNA为模板，以一种或多种NTP，以为底物，用T7RNA聚合酶进行体外转录得到了相应的FLAG-EGF，并通过PAGE进行了分析，计算得到了不同组合中mRNA的相对量（图2a）。作者发现，在所有组合中都能观察到目标mRNA，且产量随着NTPA现种类增加而普遍降低。作者将PS-mRNA纯化，以相同的浓度在PUREsystem中进行翻译（图2b）。通过Westernblot分析，作者计算了相对于PO-mRNA的PS-mRNA的蛋白产量。作者发现，在15个PS-mRNA中，有12个与PO-mRNA的产量相同或更高。其中，只将CTPαS作为底物，相对比值最高。随着NTP物，的种类增多，mRNA的耐受性降低。在多种NTP性降的组合中，使用UTPαS和CTPαS为底物时，相对比值为2.2。同样，作者也对另外两个序列进行了一种NTP作者取代发现，相对于PO-mRNA，所有的PS-mRNA的蛋白产量均增加。

之后，作者从以下两方面分析了PS修饰使得FLAG-EGFmRNA翻译效率提高的原因。第一，作者将PS（U,C）-mRNA和相应的PO-mRNA的转录混合物通过RT-PCR定量分析，发现两个mRNA在稳定性方面无显著差异。即在核酸酶水平大大降低的大肠杆菌无细胞翻译系统中，mRNA的降解不太可能。因此，PS-mRNA的稳定性不被考虑为是提高翻译效率的一个关键因素。第二，在翻译过程中，核糖体与mRNA形成复合物的起始步骤是限速步。作者假设PS修饰的mRNA可能会增加起始速率，从而提高翻译效率。因此，作者建立了一个核糖体不会从mRNA上解离下来的体系，以计算初始翻译速率（图4）。在该体系中，作者在FLAG-EGF的末端引入三个重复的脯氨酸密码子CCA,即FLAG-EGF-Pro3mRNA；在没有延长因子P的情况下，使得核糖体翻译停顿，得到蛋白与tRNA相连的37KD的翻译产物。作者通过Westernblot比较了PS（U,C）-mRNA和PO-mRNA的翻译反应（图4b），并用RNaseA处理以降解tRNA，得到FLAG-EGFmRNA的15KD的翻译产物（图4c）。作者通过比较37KD产物随时间变化图的x轴截距得出，PO-mRNA翻译过程中的延长速率快于PS(U，C)-mRNA。从斜率可以看出，PS(U，C)-mRNA的初始翻译速率比PO-mRNA快大约两倍。即PS修饰促进了核糖体与mRNA起始复合物的形成。

然后，作者在FLAG-EGF的基础上研究了PS修饰的位置对蛋白质合成的影响。作者分别设计了两种衍生物，5’-PS（A,C）-mRNA和3’-PS（A,C）-mRNA。前者是将PS引入5’端的34-nt区域，其主要是非翻译区。后者是将PS引入3’端的250-nt区域，其中包含翻译区（图5）。如图5c所示，5’-PS（A,C）-mRNA与PO-mRNA相比，蛋白产量增加了22倍，3’-PS（A,C）-mRNA增加了0.46倍，PS（A,C）-mRNA增加了1.2倍。这一结果表明，在5’端非翻译区引入PS提高了翻译水平，而PS引入翻译区减缓了肽链的延长。作者认为，只有在5’端引入PS才能促进启动翻译。另外，作者设想PS修饰可减少具有二级结构的mRNA的数量，因此，加速核糖体复合物的形成，然而并没有得到实验支持。5’非翻译区引入PS提高蛋白质翻译水平的机制仍需进一步研究。

最后，作者证明，通过简单NTP通过替换，可实现连续的转录/翻译，提高无细胞体系的蛋白质合成效率。

综上，作者较为系统的研究了PS修饰对mRNA在无细胞体系中翻译效率的影响，为今后mRNA的应用提供了指南。

本文链接：

https://onlinelibrary.wiley.com/doi/full/10.1002/anie.202007111