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今天为大家分享的是一篇今年发表在Angew上的文章,本文的通讯作者是来自北京大学药学院的董甦伟教授和南开大学化学院轩维民教授。董甦伟老师实验室研究领域有:(1)研究和开发用于合成糖肽和糖蛋白的新方法和策略; (2)通过化学合成获得的均一结构糖蛋白及其基础上研究聚糖功能; (3)通过调节分子结构和改变外界环境来研究糖肽的自组装。轩维民老师研究领域包括:基因密码子扩展,生物探针,蛋白质修饰,大分子药物开发。
天然糖蛋白中寡糖的异质性和人工设计的糖蛋白构建困难,大大阻碍了糖生物学的基础研究和应用。在此,作者描述了一种半合成的方法,利用还原性糖对蛋白质进行定点修饰。此方法包括将侧链酯化的天冬氨酸通过基因掺入蛋白质,随后将其定量转化为丙氨酸-β-酰肼(Aβz),并将Aβz与一系列易得的还原糖进行化学选择性结合。 Scheme 1.利用还原糖的蛋白质进行位点特异性修饰示意图 由于L-天冬氨酸β-苄基酯(BnD,图1A)的强稳定性和商业应用,作者将BnD作为研究对象。并且SDS-PAGE分析(图1B)和ESI-QTOF质谱分析(图1C)表明BnD成功掺入GFP,构建了sfGFP-Y151TAG突变体。 Fig 1. BnD的遗传掺入 接下来,通过去除C末端的7个氨基酸来构建一个sfGFP变异体,以减少存储和处理过程中不希望发生的蛋白水解裂解,并标记为ctGFP。根据设计的路线(图2A),将蛋白质上的BnD转化为Aβz。ESI-QTOF质谱分析表明10%的肼可以导致BnD完全转化为Aβz(图2C)。 由于Aβz-GlcNAc类似于天然的N-GlcNAc,作者使用N-GlcNAc作为代表性的还原糖来评估连接反应。 Fig 2. BnD肼解法将Aβz-GlcNAc导入ctGFP-Y151 随后作者研究可以与蛋白质上的Aβz共轭的还原糖的范围(图3)。 Fig 3.评估可与ctGFP-Y151上的Aβz反应的还原糖的范围 由于Aβz-GlcNAc被视为天然N-GlcNAc的模仿物,作者试图用Aβz-GlcNAc作为替代物来构建自然发生的N-连接糖蛋白。首先作者选取了白细胞介素-17A(IL-17A,图4A)糖蛋白作为研究对象,着手制备一种在Asn45处有Aβz-GlcNAc的IL-17A衍生物。简而言之,在大肠杆菌中重组表达在Asn45处携带BnD的IL-17A(IL-17A-N45BnD)。通过SDS-PAGE和ESI-QTOF质谱分析所得产物,确认主要形成二聚体IL-17A-N45Aβz(图4B,C)。最后,IL-17A-N45Aβz与GlcNAc在37℃的pH4缓冲溶液中反应,并导致IL-17A-N45Aβz-GlcNAc主要以二聚体形式出现。值得注意的是,在N45处引入Aβz-GlcNAc后,IL-17A的热稳定性提高到与N-GlcNAc相类似的水平(76℃)(图4D)。 Fig 4. IL-17A-N45Aβz-GlcNAc的制备和表征 同时,作者将这个体系相似的应用到RNase A蛋白上,也观察到相同的结果(图5)。 Fig 5. RNase A-N34AβZ-GlcNAc的制备和表征 为了评估Aβz-GlcNAc是否可以成为内切酶催化的转糖基化反应的底物,作者使用了具有转糖基化活性的Endo M变体(Endo MN175Q)和半合成的双烯基寡糖噁唑啉衍生物(SCT-ox)(图6A)。HPLC-MS表征可以观察到所需的糖基化的蛋白产物,产量大概在10%和40%(图6B,C)。 Fig 6.评估内切酶催化的转糖基化反应对含有引入Aβz-GlcNAc分子的蛋白质的影响 最后,为了研究在天然糖基化位点从Aβz-GlcNAc组装复合糖的潜力,利用前面制备的RNase A-N34Aβz-GlcNAc用作转糖基化反应的底物(图7A)。根据HPLC-MS分析,Endo MN175Q可以将SCT-ox转移到RNase A-N34Aβz-GlcNAc上(图7B)。 Fig 7. RNase A-N34Aβz-GlcNAc糖基化策略 综上所述,本文介绍了一种半合成方法,通过各种还原糖对蛋白质进行定点修饰。这种方法涉及到一种酯化天冬氨酸类似物的遗传结合,它的定量转化为酰肼,最终结合易得的还原糖,大大提高了制备人工设计的糖蛋白的能力。特别是,GlcNAc可以有效地、选择性地导入到各种Aβz基因的蛋白质中。更重要的是,由此产生的Aβz-GlcNAc是一个非常接近于N-GlcNAc的模拟物,并允许通过内糖苷酶催化的转糖基化反应快速生成复杂的糖链。总的来说,这里的工作提供了创新的途径来制备均一的糖蛋白,并可能有助于解决糖蛋白基础研究和应用中的挑战。 文章作者:WCJ 原文引用:10.1002/anie.202116545 责任编辑:LD
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