为大家介绍一篇2021年发表在Angew.Chem., Int. Ed.上的文章“Single-Cell Imaging of m⁶A Modified RNA Using m⁶A-Specific In Situ Hybridization Mediated Proximity Ligation Assay (m⁶AISH-PLA)”，该研究介绍了一种单细胞内、单分子水平原位成像m⁶A修饰的新方法，作者是来自清华大学的李景虹教授，该课题组研究方向主要有单细胞核酸成像、生物传感、电化学分析研究等。

【研究背景】

N⁶-methyladenosine(m⁶A)是哺乳动物mRNA的主要修饰方式，该修饰会对多个生物学过程产生重要影响，包括基因调控、mRNA翻译和剪切等。此外，mRNA的特定位点产生m⁶A修饰还会导致多种疾病的发生。实现单细胞、单分子水平的m⁶A修饰标记对于研究m⁶A相关疾病、后翻译修饰调控等进程具有重要意义。目前发展的许多m⁶A分析方法，包括高通量测序、免疫共沉淀、色谱分析法等，难以在保留空间信息的同时实现单细胞水平、单分子水平、单碱基分辨率的m⁶A分析，基于此本文发展了m⁶AISH-PLA(m⁶A-specific in situ hybridization mediated proximity ligationassay)技术，可以在单分子分辨率下原位成像单细胞内RNA上的m⁶A修饰位点，实现了不同单细胞间m⁶A修饰的空间分布异质性研究。

【工作原理】

m⁶AISH-PLA的工作原理如图1所示，该体系主要基于邻位连接反应（PLA）进行。作者采用兔单克隆anti-m⁶A抗体靶向识别并结合m⁶A修饰位点，用带有邻位连接探针b修饰的抗兔IgG抗体结合该抗体，再用探针a序列特异性靶向杂交m⁶A修饰的mRNA序列，当mRNA与m⁶A的识别结合事件同时发生时，探针a与探针b在空间上相互接近，用circle-1与circle-2序列与之互相杂交，便可进行DNA连接反应使circle探针形成圆环DNA。利用滚环扩增 (RCA) 反应对圆环DNA扩增后，用荧光探针与之靶向结合，便可实现信号的放大，从而实现m⁶A修饰位点的高分辨单分子成像。

图1 m⁶AISH-PLA的工作原理

为验证该策略的可行性以及优化反应体系，作者利用合成的m⁶A HSP70 RNA片段，设计了如图2A中的实验，通过PLA的产物激发分子信标的荧光信号来评估优化结果。作者先对探针A在序列上的结合方向进行优化，“right bracket”对比“left bracket”具有更高的荧光信号（图2A中为“right bracket”的方向），证明a探针在该结合方向下具有更强的ligation效率。下一步作者对比了探针a在mRNA上不同杂交位置的效率（图2C），从图2D中来看，15nt位置具有最强的荧光信号，证明距离太短可能会导致抗体结合产生空间阻碍效应，而距离太长可能会导致与探针b进行邻近连接效率降低。下一步，作者评估了m⁶AISH-PLA对于识别m⁶A修饰的准确性和特异性，如图2E所示，当没有邻近探针a、或探针a被block、或结合随机序列、或识别位点被封闭时均无明显荧光信号，而阳性对照组荧光信号显著高于其他实验组，证明m⁶AISH-PLA可以特异性识别靶向特定的序列和具体的m⁶A修饰位点。

图2 验证m⁶AISH-PLA体系可行性

为验证m⁶AISH-PLA是否可以用于原位m⁶A修饰的RNA成像，作者设计了靶向HSP70第103位点的m⁶A的探针与一系列具有不同变量的实验组（图3A），HSP70基因编码的是热休克蛋白，在细胞蛋白代谢中具有重要的作用，HSP70的N⁶甲基化与应答热休克压力的选择性翻译相关。如图3A所示，从靶标m⁶A位点扩增出的荧光信号可以与背景信号明显区分，定量结果显示每个细胞可以检测出12.72个扩增子。下一步，作者利用CRISPR/Cas9对甲基酶METTL3进行敲除来抑制m⁶A的修饰水平，在基因敲除后，荧光下降了70.13%，进一步证明了该荧光信号来源于m⁶A修饰。

下一步，作者利用m⁶AISH-PLA和原位RCA来研究细胞应答热休克时m⁶A修饰水平的动态变化情况，如图3B和3C所示，在热休克后mRNA和m⁶A的表达水平均上升，说明m⁶A修饰是在热休克施加后产生的，并且上升的水平在不同细胞间具有异质性，该结果同时也证明m⁶AISH-PLA不仅可以在单细胞水平精准定量m⁶A修饰水平，还可以提供细胞间异质性的信息。

图3 m⁶AISH-PLA用于单细胞内原位成像m⁶A

下一步作者利用m⁶AISH-PLA来研究m⁶A修饰的RNA在亚细胞水平上的分布情况，结果如图4A所示，在热休克后每个m⁶A修饰的RNA分子之间的平均距离为0.93 μm，当细胞未经热休克处理时，41.54%的RCA扩增子分布在细胞质，而热休克处理后该比例提升至63.91%，因此在热休克后，HSP70的RNA103-m⁶A分子在细胞质的分布比例会增加，说明m⁶A的甲基化水平和空间分布是和外界受到的刺激引起的细胞功能变化息息相关的，也证明m⁶AISH-PLA方法可以揭示甲基化水平是如何影响mRNA的空间分布的。

图4 研究Hepa1-6细胞中HSP70 RNA103-m⁶A的空间分布

本文发展了m⁶AISH-PLA方法，利用双分子识别和邻位连接反应实现特定m⁶A修饰位点的精准定位以及单分子、单细胞水平成像，可用于揭示细胞间的m⁶A异质性的表达水平和空间分布，未来有希望应用于临床组织中的RNA甲基化水平分析。