今天分享一篇发表在Angew. Chem. Int. Ed.上题为Cysteine-Assisted Click-Chemistry for Proximity-Driven, Site-Specific Acetylation of Histones的文章。文章的通讯作者是剑桥大学的Gonçalo J. L. Bernardes教授。

组蛋白的翻译后修饰对染色质结构和功能的调控至关重要。乙酰化是一种常见的翻译后修饰，发生在组蛋白赖氨酸(赖氨酸或K)残基的ɛ-胺侧链上。乙酰基的转移中和了赖氨酸残基的正电荷，从而减少了组蛋白与DNA的相互作用，浓缩的染色质转化为一种更宽松的结构，这有利于转录因子接近DNA，进而促进下游基因的转录。尽管组蛋白中有许多乙酰化标记，但是很难获得含有单个乙酰基的组蛋白样本，因此对单个位点的功能研究非常有限。作者提出了一种新的策略，将半胱氨酸偶联与点击化学结合，使组蛋白上单个近端赖氨酸残基特异性位点发生乙酰化（图1）。

鉴于两步结合反应在多肽中起到各自的作用，作者进行了两个额外的试验。首先通过反式迈克尔加成的硫醇交换去除仍附着在半胱氨酸残基上的SPAAC反应副产物。β-巯基乙醇作为硫醇化合物，在这个过程中发生了不可逆的马来酰亚胺水解，这导致大量(20-30%)的副产物未改变。此外，还观察到在反式迈克尔加成后乙酰化的K9水解(20%)，产生未修饰的K4C和K14C肽。这些实验证明了半胱氨酸辅助点击化学在驱动近端特定位点赖氨酸乙酰化的可行性，并证明了其在多肽上近端驱动乙酰化方面的潜力。

接下来，作者用一种依赖NAD+的组蛋白去乙酰化酶识别乙酰化肽，在适合发生去乙酰化的条件下，将修饰过的K4C和K14C肽与Sirt6孵育，可以去除组蛋白H3特异性赖氨酸残基K9和K56。虽然去乙酰化是不完全的，但观察到两个多肽的结果之间的显著差异。对于修饰的K4C肽，脱乙酰产物的转化率为40%，而修饰的K14C肽的转化率为< 20%。这些结果作为初步的数据来证明修饰的多肽能够被组蛋白去乙酰化酶识别。对单一半胱氨酸突变体H3K4C的全长蛋白进行了与K4C和K14C肽相同的反应，得到相应的单乙酰化产物H3K4C**K9Ac，分析三个蛋白(H3K4C, H3K4C**和H3K4C**K9Ac)的圆二色(CD)图谱表明H3K4C的整体二级结构在半胱氨酸结合和SPAAC反应后均没有改变。高分辨率FT-ICR质谱和MS/MS实验结果显示仅在残留K9处发生乙酰化，证实了这种方法的位点特异性。

最后，作者测试了这种策略是否会干扰修饰原本的性质。作者验证化学乙酰化的H3K4C**K9Ac和H3R52C**K56Ac蛋白是否被其同源抗体识别为抗原（图４）。Western blot和ELISA实验表明，针对天然的ɛ-乙酰赖氨酸在H3的9位和56位产生的抗体分别与H3K4C**K9Ac和H3R52C**K56Ac结合，使用抗H3K9Ac抗体的Western blot没有显示H3R52C**K56Ac蛋白的信号。当产生一个双位点特异性的H3K4C**K9AcR52C**K56Ac时，在9和56位乙酰化赖氨酸都得到了印迹信号。Sirt3是一种依赖NAD +的组蛋白去乙酰化酶,两种蛋白用Sirt3孵育均出现了显著的去乙酰化。以上结果说明邻近位置Cys突变以及额外引入的click部分没有对修饰产生非常大的干扰。

综上所述，作者开发了一种利用半胱氨酸突变结合点击化学的方法，驱动赖氨酸残基的定向位点特异性乙酰化。方法包括两个连续的步骤:蛋白质的独特半胱氨酸马来酰亚胺- DBCO之间反应，然后是DBCO和带有乙酰基供体的叠氮化合物之间的SPAAC反应。然后，乙酰基供体羰基上最近的赖氨酸侧链胺亲核攻击触发自发乙酰化。这种方法可用于蛋白质特定位点上翻译后修饰机制和功能的研究中。

原文链接：https://doi.org/10.1002/anie.202208543