DNA甲基化是一个重要的基因组的表观遗传修饰。其中5hmC被证明与很多疾病的发生有关，因此，对5hmC的高灵敏检测是十分重要的。本文提出了一种单分子测序的方法，利用亚硫酸氢盐在温和的条件下介导5hmC生物素化，通过修饰有链霉亲和素的纳米孔富集5hmC达到检测的效果。

DNA甲基化是一个重要的基因组的表观遗传修饰。例如，5-甲基胞嘧啶（5-methylcytosine，5-methylcytosine，5-mc）在肿瘤发生与发育相关的基因表达调控中起着关键作用。最近，5-羟甲基胞嘧啶（5hmC）、5-甲酰胞嘧啶（5fC）、和5-羧化胞嘧啶也发现于哺乳动物DNA。5hmC碱基水平和分布的变化可能与胚胎干细胞的维持和分化及其转录调控细胞有关。5hmC也被证明在中枢神经系统细胞的染色质结构和基因表达的调节中发挥作用。

因此，开发DNA检测基因组表观遗传碱基的方法是非常重要的。一种基于亚硫酸氢盐处理、PCR扩增和核苷酸序列分析的方法已经成为DNA中检测5mC的常规方法。其中，亚硫酸氢盐处理可将胞嘧啶（C）转化为尿嘧啶（U；图1a），而5mC保持完整（图1b）。然而，这种方法无法区分5hmC，因为5hmC转化为胞嘧啶5-亚甲基磺酸盐（CMS）在过程中，在PCR扩增过程中表现为C残基（图1C）。为了克服这一问题，最近开发了一种氧化亚硫酸氢盐测序方法，以单碱基分辨率定位5hmC。通过高钌酸钾（KRuO4）将5hmC选择性化学氧化为5fC，使5fC转化为尿嘧啶。将氧化/亚硫酸氢盐处理的DNA序列与未处理和仅亚硫酸氢盐处理的DNA序列进行比较，以区分C、5mC和5hmC。在第二种酶法和化学法相结合的方法中，5hmC在测序前转化为C，C和5mC转化为U。通过用葡萄糖基转移酶对5hmC进行酶修饰，然后用生物素标记进行化学修饰，也实现了对含有5hmC的DNA进行定向测序的富集。DNA甲基转移酶导向的巯基和硒醇取代了DNA中5hmC的羟基，这也使得随后能够用含生物素或荧光素的基团进行修饰。然而，使用具有受限识别基序的昂贵酶，需要合成酶辅因子或底物的类似物，这些方法的缺点是核碱基修饰需要多个步骤。

单分子测序的修改碱基在未扩增的DNA是一个有吸引力的替代方法。纳米孔方法是单分子DNA测序的一个很有前途的替代方法，最近完成了四个标准碱基（G，a，C和T）的测序。实验证明了链测序的碱基识别的可行性，生物素化的DNA链被固定在一个与链霉亲和素结合后的工程蛋白孔阻止了通过孔的易位。这样，5hmC和5mC可以与G、A、C或T区分开来。在此，本研究报告了一种替代方法，其中5hmC在原位进行化学修饰，允许在单分子水平上富集稀有的含5hmC的序列并用蛋白质纳米孔进行鉴定。

图一：C、5mC、5hmC在不同条件下的反应原理图

亚硫酸氢钠将5hmC转化为CMS磺酸盐的5-羟基（图1c）。本研究推测CMS是通过形成外亚甲基中间体产生，随后亲核亚硫酸盐阴离子攻击的机制。如果这一机制是正确的，亲核硫醇盐应该捕获外亚甲基中间体以形成相应的5-硫甲基衍生物（图1c）。我们通过使用两种模型化合物（5hmC和5-羟甲基-2'-脱氧胞苷（5hmdC））。反应在pD 5.0的重水中存在亚硫酸氢盐的情况下，5hmC含有过量的谷胱甘肽（GSH）或1-硫代-b-二葡萄糖得到CMS（25%）和硫取代的5hmC加合物（SMC，75%）。

当反应的pD从5.0增加到7.0时，反应速率降低。这表明5hmC的N-3原子在pD5.0上质子化，引发外亚甲基中间体的形成比硫醇的脱质子化更重要，这将提供更高浓度的亲核硫醇盐。在另一种可能的途径中，亚硫酸氢钠与5hmC的5-羟基反应形成亚硫酸盐酯，该酯随后经历亲核硫酸盐或第二亚硫酸盐阴离子的取代。在相同条件下，G、A、T和5mC（作为核苷）不变（数据未显示）。值得注意的是，在GSH和亚硫酸氢钠存在下，胞苷中的核碱基C经历了最初的攻击亚硫酸氢盐形成5,6-二氢胞苷-6-磺酸盐，但在相对较低的亚硫酸氢盐浓度下未经水解脱氨生成U，并且使用的低温。硫醇衍生物（如谷胱甘肽）不起反应。5,6-二氢胞苷-6-磺酸盐（NMR数据未显示）。已知亚硫酸氢盐参与脱氨步骤在随后的碱处理期间（用10N NaOH水溶液调节至pH 13），5,6-二氢胞嘧啶-6-磺酸盐碱基转变回C而不是U（图1a）。

其次，在pH5.0条件下，用亚硫酸氢盐在较低的浓度和温度下对ssDNA-1的5hmC进行修饰。在42℃下存在过量GSH 36–48小时（条件2），然后进行碱处理（图1和2a）。UPLC-MS显示GSH与ssDNA的加合物（ssDNA-1-SG，产率约70%）和磺化DNA加合物（ssDNA-1-CMS，产率约30%）；基于质谱峰的相对强度；图3a，b）。在70℃下4小时或42℃下15小时，反应不完全。C不能转换成U发生，5mC也没有变化。根据UPLC-MS分析（数据未显示），在ssDNA-4的对照实验中，将ssDNA-1的5hmC和5mC分别替换为5mC和C，未观察到任何核碱基的修饰（包括C转化为U）。因此，ssDNA-1和ssDNA-4的化学性质与模型单核苷酸一致。

图二：利用两步合成法和一步合成法对5hmC修饰的流程图

探讨了两种方法将生物素在5hmC位点转化为单链DAN。首先，N端选择性地测定了ssDNA-1-SG中GSH的伯胺，用生物素-羟基磺基琥珀酰亚胺酯修饰，产率在50%到95%之间，这取决于试剂中连接体的长度（图2a和3c）。含DNA的5hmC经两步生物素化的总收率为30～65%。类似地，荧光素可使用N-羟基琥珀酰亚胺酯并入，产率为约60%（数据未显示）。第二，合成生物素半胱氨酸衍生物用于单链DNA-1和100-mer单链DNA中5hmC位点生物素的掺入，产率在35-55%之间，如UPLC-MS所示（图3d）。重要的是，通过使用固定化链霉亲和素可以富集生物素化的ssDNA。

图三：ssDNA-1及其修饰产物的UPLC-MS表征

然后使用野生型葡萄球菌a-溶血素（aHL）蛋白纳米孔（未针对核碱基检测进行优化）[33]检测细胞中修饰了5hmC单链DNA，使用链霉亲和素方法固定40-mer单链DNA（DNA40-hmC，图4a），包含来自人类胚胎干细胞的POU5F基因（5'-TATACAGGCGXGATGTGGGG-3'）片段，其中相对于3'-末端（X）的位置9处的5mC被5hmC替换。3'端的生物素化将5hmC放置在固定化DNA 40-hmC中，位于aHL孔管腔收缩附近的识别部位。在DNA 40-hmC和链霉亲和素的存在下开孔电流（IO）下降到一个新的水平（IB；图4b）。IRES%值的直方图（IRES%=（IB/IO）100）显示一个主峰，IRES%=11.8±0.1（图4b，c），该主峰被设置为零，以便与改良的ssDNA进行进一步比较。当DNA40-hmC被谷胱甘肽和亚硫酸氢盐的反应，然后添加到已经包含DNA40-hmC的记录室，直方图显示两个附加峰，分别对应于谷胱甘肽-单链DNA结合物（DNA40-SG）和磺化单链DNA结合物（DNA40-CMS）；图4 c）。与DNA40-hmC相比，具有较大位移（∆IRES%=-2.7±0.1）的峰被暂定为DNA40-SG，因为GSH的尺寸比磺酸基大。在40-mer ssDNAs的对照实验中，位置9为5mC、G、A、C或T，在用谷胱甘肽和亚硫酸氢钠处理以及随后添加碱调pH后，电记录的直方图显示没有变化（数据未显示）。因此，化学修饰和纳米孔分析的结合使我们能够利用野生型aHL孔检测ssDNA中的5hmC。

图四：野生型aHL孔固定化ssDNA中修饰5hmC的检测

总之，作者描述了一个简单的非酶改性5hmC，亚硫酸氢钠介导的硫醇取代，它允许偶联肽，荧光素和生物素等物质的修饰，这一步生物素化程序应该是一个很好的方法来丰富5hmC含有DNA片段。通过纳米孔分析，修饰的5hmC残基可以很容易地与其他碱基区分开来，这为单分子测序在未扩增的DNA中定位表观遗传标记提供了基础。这种方法可以推广到其他表观遗传碱基，如5fC，其中醛基可通过肼和氨基氧基衍生物进行特异性修饰。