Angew.chem. | 噻唑硼酸盐介导酰基转移快速稳定地修饰N-末端半胱氨酸

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分享一篇发表在angew.chem.上的文章“Fast and Stable N-Terminal Cysteine Modification via Thiazolidino Boronate Mediated Acyl Transfer”。通讯作者是波士顿学院化学系的高建民教授。实验室主要从事有机化学和化学生物学的研究。


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用于位点特异性蛋白质修饰的生物相容性反应因其广泛的应用而备受关注。虽然非天然氨基酸的使用可以为蛋白质标记提供一种可能,但以特定位点的方式修饰天然蛋白质仍然是一个巨大的挑战。为此,已经报道了许多由蛋白原性氨基酸组成的肽标签可以选择性修饰标记蛋白。然而,这些肽标签通常尺寸相当大,大多需要将酶添加到反应中并随后去除。


N末端的蛋白质修饰提供了一种替代方法,它具有位点特异性,对蛋白质功能的干扰最小。特别是N端半胱氨酸(NCys)的独特反应性,产生了天然化学连接(NCL)以及2-氰基苯并噻唑(CBT)缩合化学。但由于动力学缓慢和/或NCys选择性不佳,这些反应在生物应用中不太理想。最近报道了一种新的NCys修饰化学,其中2-甲酰基苯硼酸(2-FPBA)与NCys快速偶联,得到噻唑基硼酸酯(TzB)配合物。然而,TzB的形成是动态的,结合物在一个小时内解离。为了克服这个问题,作者在这里报道了TzB介导的NCys酰化反应,该反应提供了稳定的共轭物,同时保持了TzB化学的快速动力学和NCys选择性。通过两种模型酶和噬菌体的简易标记来证明该方法的实用性。


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首先,作者合成了2-FPBA的乙酰酯(KL42),用1H-NMR,LC-MS和X-射线晶体学研究了它对模型肽的反应性。当在中性磷酸盐缓冲液中与小肽P1(Cys-Leu-Ala)混合时,KL42立即诱导形成了一个TzB共轭物KL43P1。


接下来,作者使用荧光团标记的H-CLA(Dap-FAM)-NH2序列P1*对N-酰基噻唑烷偶联物的稳定性进行了测试。首先,在LC-MS分析中,KL44P1*没有降解。此外,当与游离半胱氨酸混合时,没有观察到KL44和游离半胱氨酸的交换。KL44在pH为5或7的条件下,6天内几乎没有降解。这些结果均表明了N-酰基噻唑烷产物的稳定性。


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为了探索这种化学的普遍适用性,作者比较了KL42与NCys后分别含有Gly、Trp和Pro的多肽的结合情况。观察到所有这些肽的有效偶联。此外,添加10%胎牛血清对肽标记的影响最小,显示了该方法的出色生物相容性。


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作者进一步测试了TzB介导的NCys偶联标记大蛋白。为此,重组表达了偶氮还原酶(AzoR)和硫氧还蛋白(Trx)两个模型蛋白,其N端分别携带TEV蛋白酶切割位点(ENLYGQC)和Xa因子切割位点(IEGRC)。通过酶解暴露出末端的半胱氨酸残基,用KL42处理NCys蛋白(Cys-AzoR和Cys-Trx),结果表明引发了Cys-Azor的完全标记;KL42处理Cys-Trx对该酶活性影响最小。Trx有五个功能上重要的半胱氨酸残基,显然不受KL42处理的影响,进一步支持了KL42对NCys的极高选择性。为了扩大该蛋白质标记的应用范围,作者还合成了KL42的生物素衍生物,即KL72。KL72与Cys-Azor混合显示了蛋白质有效的生物素化。


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噬菌体展示是一个强大的筛选平台,可以方便地发现肽探针和抑制剂。然而,这项强大的技术仅限于由蛋白性氨基酸组成的肽。化学选择性和位点特异性噬菌体修饰将使噬菌体表现出非蛋白原功能。为此,作者在M13噬菌体上制备了一个肽库,该肽库在PIII蛋白的末端加入了一个因子Xa切割位点(IEGR),后面是C(X)7C肽库。通过Xa因子切割,随后二硫键还原,从而在PIII蛋白上产生游离的NCys。用KL72处理产生的噬菌体,通过ELISA实验结果显示KL72能有效地诱导噬菌体的生物素化,并且没有明显影响噬菌体的感染性。


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综上所述,作者描述了一种新的用于快速和高度特异的NCys修饰的共轭化学。通过TzB中间体的快速形成,然后分子内酰基转移得到稳定的N-酰基噻唑烷。使用两个模型蛋白,展示了携带NCys的蛋白的高效和特异性标记。此外,通过实验表明这种方法可以应用于以位点特异性的方式将非自然功能安装到噬菌体上,这为仍然非常有限的用于创建化学修饰噬菌体文库的方法提供了强大的补充。



原文链接:

https://doi.org/10.1002/anie.202000837


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