细菌苏氨酸磷酸裂解酶(或磷酸裂解酶，phospholyases,)是一类毒力因子家族，能够不可逆地催化β-消除磷酸化苏氨酸(_PThr)或丝氨酸(_PSer)残基中磷酸，生成脱氢氨基丁酸(Dhb)或脱氢丙氨酸(Dha)。细菌在侵染细胞后，可利用苏氨酸磷酸裂解酶通过β-消除ERK1/2活化环(ERK1/2activation loop)上的_pThr而使丝裂原活化酶(MAPK)信号失活，从而减弱先天免疫反应。此前，塔夫茨大学的Prof. Rebecca Scheck课题组研究确定，相较于_PSer，磷酸裂解酶更倾向于_PThr，因此Dhb的研究对于磷酸解酶活性的全局分析是至关重要的。

以往的报道中，在生物相容的条件下，亲核基团，特别是硫醇与α，β-不饱和官能团的Michael加成比较容易发生，并已经应用于修饰细胞中含Dha的蛋白质。然而迄今为止，只有少数报道使用了Michael加成来标记含有Dhb的蛋白或肽。值得注意的是，这些方法都需要较高的pH(10-13)和/或高温(50-90℃)来加速反应。然而，磷酸化或糖基化的丝氨酸和苏氨酸残基很容易经碱催化发生β-消除，从而产生Dha以及Dha。综上，由于缺少生物相容性的方法来选择性富集Dhb修饰的蛋白质，磷酸水解酶底物的鉴定仍然具有挑战性。近期在Angew Chem.上，Scheck课题组报道了一种亲核膦探针，它能够在生物相容性条件下选择性地标记哺乳细胞裂解物中Dhb修饰的肽和蛋白质。

图1.细菌磷酸解酶催化从含磷酸丝氨酸或磷酸苏氨酸的蛋白质消除磷酸，生成的脱氢丙氨酸(DHA)或脱氢氨基丁酸碱(Dhb)结构可以被亲核探针标记。

为了确定巯基-Michael加成是否能够应该用于Dha、Dhb的多肽和蛋白质的修饰，Scheck课题组首先对比了β-巯基乙醇(βME)分别标记含有Dha、Dhb的ERK1/2活化环 [H-GFL-Dha-EyV-NH2(肽A)和H-GFL-Dhb-EyV-NH2(肽B)]。在相同的条件下，肽A能够被定量标记，但是只能观察到微量肽B的标记产物。作者推断可能是由于Dhb上甲基的空间位阻和超共轭使得其亲电性低于Dha，表现出了对脂肪族硫醇加成的抵抗力。随后，作者们继续评估了一组亲核试剂与肽B之间的反应，同样，无论是巯基化合物还是其他的亲核试剂均不能有效地对肽B进行标记(图2)。

图2.在肽A（靛蓝）和肽B（青色）与一系列亲核试剂（A，半胱胺；B，2-巯基乙醇；C，苄胺：D，吡咯烷；E，咪唑；F，4-乙氧基苄胺；G，苯胺）在温和条件下的反应。通过LCMS评估转化率。

基于以上实验以及最近报道的TCEP(三(2-羧乙基)膦)与α，β-不饱和酰胺的Phospha-Michael加成反应(J. Am. Chem. Soc.2018, 140, 14, 4757-4760)，Scheck课题组选择使用TCEP对上述的两种肽进行标记。在孵育24小时后，两种肽都能够实现定量修饰(图3-C)。作者测定了肽A的膦加成反应的二级速率常数(k=2.6×10^-1M^-1s^-1) ，发现在相同条件下，它比与硫醇加成反应(k=5.2×10^-3M^-1s^-1)快约2个数量级。这表明Phospha-Michael反应在动力学上是有利的，与以前的报道一致。众所周知，膦类化合物相对于硫醇具有更强的亲核性，并且经常被用作催化剂，特别是在Michael和Bayliss-Hillman反应中。此外，与βME(pK_a=9.6)相比，TCEP具有更低的pK_a(pK_a=7.6)，因此更适合于近中性pH下的反应。此外，TCEP与Dhb底物反应的二级速率常数(k=2.5×10^-3M^-1s^-1)和巴豆酰底物的二级速率常数(k=6×10^-4M^-1s^-1)相似。因此，这是迄今为止报道的第一个能够在生物相容性条件下修饰含Dhb物种的反应，且TCEP修饰后产物表现出良好的稳定性。

图3.A) 用βME(左)或TCEP(右)修饰含Dha或Dhb的肽(肽A、肽B)；B) 与βME隔夜孵育后，肽A被定量修饰；C) 与TCEP隔夜孵育后，肽A和肽B均被定量定量修饰。

为了在细胞环境中利用该反应，Scheck课题组合成了生物素化巯基化合物(1)、生物素化膦(2)两种探针(图4-B)，用于检测A431细胞中的磷酸裂解酶产物。A431，人表皮鳞癌细胞，能够过表达表皮生长因子(EGF)受体，表现出包括ERK1/2在内的下游激酶的结构性激活。当A431细胞裂解物被福氏志贺氏菌的重组OspF(一种磷酸化酶)处理之后，作者观察到与磷酸化的ERKK1/2相对应的信号完全丧失。随后，作者将裂解产物暴露于探针1或2(1mM)；当用探针2处理裂解产物时，出现了符合预期分子量的生物素化条带(图4-C，红色箭头)。随后用免疫沉淀证实ERK1/2是OspF的蛋白靶标。该实验表明，探针2可以修饰细胞裂解物中含有Dhb的蛋白，而探针1不能。此外，探针1对细胞蛋白的非特异性标记远远超过探针2，表明膦探针对其预期的蛋白靶标(Dhb修饰蛋白)具有更高的选择性。

图4.A) 活化的ERK1/2，经由OspF处理后得到Dhb修饰的蛋白，随后用亲核探针进行标记；B)探针1和2的化学结构；C) A431细胞裂解物在OspF处理后用探针1或2标记。ERK1/2经OspF处理后产生Dhb，可被探针2修饰。（*表示与探针无关的α-生物素抗体的非特异性条带)

如图4-C所示，作者推断在没有OspF的情况下观察到的背景信号，可能是由于探针2修饰内源性α，β-不饱和亲电体所致(据报道，探针2已经被用来检测蛋白质赖氨酸巴豆酰化)。所以作者决定使用组蛋白H3——一个众所周知的赖氨酸巴豆酰化的靶标，进行同样的实验。在没有OspF的情况下，没有发现H3下拉现象，因此表明在实验条件下，内源性的巴豆酰化背景可以忽略。在同时使用OspF和探针2的情况下，作者观察到H3强烈的下拉信号(图5-A)。结果预示，磷酸化的组蛋白H3是OspF的直接靶标。

图5.Western Blot分析±OspF，±探针2处理的A431 细胞裂解液A) 以及裂解液的免疫沉淀样品B)。。在同时用OspF和探针2处理的泳道，有ERK1/2和组蛋白H3的富集；仅用探针2，未能观察到H3条带。

综上，Scheck课题组报道了一种可以在生物相容条件下检测含有Dhb的肽或蛋白质的亲核膦探针。该探针有助于鉴定新的磷酸裂解酶靶标，分析细菌感染的生物标志物，以及开发酶介导的生物正交标记策略。

相关链接：

https://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/anie.202003631

Prof. Dr. R. A. Scheck课题组：

https://chem.tufts.edu/faculty/scheck/