给大家介绍一篇发表在Angew. Chem. Int. Ed.的文章，题目为“Protein Labeling and Crosslinking by Covalent Aptamers”。该文章发展了一种使用亲电共价适体在生物环境中选择性修饰天然蛋白质的新方法。该文章的通讯作者是匹兹堡大学的Alexander Deiters教授，研究方向为发展化学工具解决生物学和健康相关的基础科学问题。课题组网页：http://www.deiterslab.org/。
【背景介绍】
通过生物正交反应对蛋白质进行共价修饰对于许多生物学研究和基于蛋白质的疗法的开发至关重要。其中，使用亲电基团修饰小分子抑制剂和配体的方法与传统的可逆蛋白质-配体相互作用相比，共价配体的设计使得蛋白质和配体可逆结合之后，配体上的亲电基团与目标蛋白质上的亲核残基接近，发生不可逆的交联反应。小分子共价配体与非共价配体相比具有多项优势，包括能够以相似的亲和力与内源性配体竞争、较低浓度的剂量以及与蛋白质周转率相匹配的作用。然而这种方法仅适用于小分子配体及其相对应的目标蛋白，从而限制了其应用。
【设计思路】
为了将这种方法的应用范围拓展到大分子配体及其对应的目标蛋白质，作者选择了适体来作为蛋白质的结合方式。如图1所示，适体上修饰有可分离的亲电试剂，可将化学基团转移到蛋白质上。适体作为蛋白质靶标的亲和配体，将其共轭亲电基团带到蛋白质的亲核残基附近，然后通过共价交联将蛋白质选择性标记。适体在形成共价交联的同时从亲电试剂上裂解下来，与其靶标分离。
图1：共价适体对蛋白质进行标记和交联
【数据介绍】
亲电适体修饰效率表征 甲苯磺酰亲电试剂对适体不同位点进行修饰，与重组凝血酶单独孵育4h,并利用聚丙烯酰胺凝胶电泳进行表征，其中13号位点的修饰最为有效（图2A）。改用N-酰基磺酰胺亲电试剂对适体不同位点进行修饰，与重组凝血酶单独孵育1 h,并利用聚丙烯酰胺凝胶电泳进行表征，其中3号和7号位点修饰效率最高（图2B）。
图2 ：亲电适体与重组凝血酶的结合表征
影响标记效率的因素 对修饰效率不同位置 (TBA(3)和TBA(9))进行荧光偏振分析，表明标记效率的差异不是由于对适体-蛋白质相互作用的干扰，而可能由于弹头相对于蛋白质表面可及的赖氨酸残基的不同定位。亲电适体-凝血酶晶体结构表明，这些赖氨酸位于适体-蛋白质结合界面(图3A)。定量显示K149、K109-110和K36的生物素化修饰率分别为91%、74%和4%的，从而证明了手柄转移适体的位点选择性(图3B)。
图3：（A）亲电适体-凝血酶晶体结构（B）生物素化赖氨酸(绿色)和未修饰赖氨酸(红色)标记产量
共价适体的蛋白质标记选择性 将凝血酶与牛血清蛋白混合后加入亲电适体，发现凝血酶在过量牛血清白蛋白的存在下被生物素化(图4A)。为了测试该适体在凝血酶原环境中的潜在用途，将凝血酶和N-酰基磺酰胺亲电试剂3号位点修饰的适体（TBA(3)-2）在人血浆中孵育，并观察到高效的靶标记，并且未见其他蛋白质被生物素化(图4B)。随后的时间过程实验表明，在1 mM和0.5 mM的TBA(3)-2时，t1/2分别为9.6分钟和34分钟 (图4C)。因此，凝血酶的共价修饰兼具选择性佳、速度快的特征。
图4：牛血清蛋白环境与凝血酶原环境中的适体亲和表征以及时间-过程实验
亲电适体蛋白质修饰方法的普适性 为了证明不同手柄递送的普适性并简化标记蛋白质的检测，作者合成了转移亲电试剂3：二乙基氨基香豆素(DEACM)，并将其与TBA(3)偶联(图5A)。将荧光偶联产物(1 mM)用于凝血酶标记反应(图5B)，即使存在过量的牛血清白蛋白(1.5 mM)，也可将DEACM选择性转移至凝血酶。此外，当在人血浆和标记的凝血酶中测试时，共价适体对靶蛋白仍具有选择性 (图5C)。
图5：DEACM修饰的TBA(3)在牛血清蛋白环境与人血浆中的适体亲和表征
蛋白质和适体之间的共价交联 目前为止所有的共价标记反应都导致适体从蛋白质靶中释放，但 “翻转”弹头策略将导致靶标蛋白质和适体之间的共价交联，而不是转移标记(图6A)。使亲电试剂与TBA(3)共轭形成TBA(3)-4，然后在37℃的PBS中用300nM凝血酶以递增的浓度孵育1 h ，并通过SDS-PAGE进行分析 (图6B) 。变性凝胶 (图6C) 再次显示了适体的选择性交联，与之前的生物素递送适体结果相匹配(图4B)。时间-进程实验显示凝血酶交联程度在1小时内是逐渐增加的(图6D)。由于凝血酶与TBA(3)-4的交联显示出与使用TBA(3)-2的生物素化相似的反应动力学和目标选择性，作者探索了TBA化合物上其他胸苷位置的交联反应性。将交联亲电试剂4与适体结合，然后将1 μM的适体与300nM的凝血酶孵育(在PBS中37℃孵育1 h)。变性凝胶分析(图6E)表明，交联位置的依赖性类似于生物素化(图2B)，从而证明交联的可行性。凝血酶与TBA在37℃的PBS (pH 7.4)中孵育1 h。加入纤维蛋白原，在30 min内记录吸光度，然后推断凝血时间(图6F)。与未修饰的TBA相比，TBA(3)-4导致凝血时间延长了2倍，表明适体的效力可以通过共价交联得到增强。
图6：蛋白质和适体之间的共价交联
亲电适体的检测限测定 将生物素化适体TBA(3)-2与降低凝血酶浓度的PBS (pH 7.4) 在37 ℃孵育1 h 。通过蛋白质印迹测定，检测限为4 nM (图7)。与传统的蛋白质印迹法相比，这种方法更经济，因为与抗体相反，寡核苷酸可以通过化学合成快速产生，且具有较小的的批次间差异，并且有较长的保存期。
图7：TBA(3)-2的蛋白质印迹检测
【总结】
综上所述，本文开发了一种能够快速和选择性地进行蛋白质共价标记的适体。它将生物素和荧光团等功能基团转移到缓冲液和人血浆的凝血酶中。该标记具有蛋白质特异性和赖氨酸化学选择性。未来，这种方法可用于多种适配体，并且它能够使这一类重要的基于核酸的探针在蛋白质的修饰、检测和抑制方面有新的应用。
【撰稿】朱琳（博士生）
【校稿】林世超
原文链接：
https://onlinelibrary.wiley.com/doi/abs/10.1002/ange.202101174
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