今天与大家分享一篇发表在Angew. Chem. Int. Ed.上的文章，题目为Protein Labeling and Crosslinking by Covalent Aptamers，文章的通讯作者为Alexander Deiters，来自匹兹堡大学化学系，主要研究方向有用光激活的非天然氨基酸控制蛋白质功能，以及将光裂解的发色团安装到碱基和磷酸骨架上来控制核酸功能。
通过生物正交反应对蛋白质进行共价修饰对于许多生物学研究和基于蛋白质的疗法的开发至关重要。而在其生物环境中对天然蛋白质进行特定的共价修饰一直具有挑战性。已有研究方法使用亲电“弹头”修饰小分子抑制剂和配体，相比非共价配体，共价配体的设计使得可逆结合之后，配体上放置的亲电子试剂和目标蛋白质上的亲核残基之间发生邻近驱动的不可逆交联反应。小分子共价配体能够以相似的亲和力、较低浓度的剂量以及与蛋白质周转率相匹配的作用持续时间来与内源性配体竞争，可以对天然蛋白质进行特异性修饰。为了将这种方法的范围扩展到小分子配体及其相应的目标之外，本研究选择了适体充当蛋白质靶标的亲和配体，将亲电子试剂带到亲核残基附近，然后通过共价键形成选择性标记转移到蛋白质上。相比小分子抑制剂，适体在更大表面积上与其蛋白质靶标相互作用，因此，更能兼容单个核苷酸的化学修饰。
图1. 不同位置T碱基替换为亲电基团后与凝血酶温育，实现生物素标签的转移，免疫印迹法检测凝血酶的生物素化效率。
作者通过固相寡核苷酸合成，将凝血酶适体TBA序列中的6个T碱基分别替换为含炔基的EdU，再与含叠氮基团的亲电试剂1反应，制备了含生物素的亲电适体。将该亲电适体与重组凝血酶单独孵育后通过蛋白质印迹评估每个适体的基团转移效率，发现：一、适体上的“弹头”（亲电基团）所处碱基的位置对其将修饰基团（生物素）转移到凝血酶上的能力有显著影响；二、该弹头可能表现出缓慢的基团转移动力学；三、为了减少核酸酶降解带来的影响，对于有效的共价蛋白质标记，关键是利用具有快速反应速率的亲电弹头。因此，作者换用了更高反应性的N-酰基磺酰胺亲电试剂2，其显示出比甲苯磺酰1快得多的动力学，并同样显示出位置依赖性的反应性（图1）。
图2. 核酸适体TBA与凝血酶的晶体结构，凝血酶序列不同位点的赖氨酸发生生物素化反应标记的产率。
随后作者发现，用亲电试剂2修饰TBA的3号位碱基形成的TBA(3)-2在与凝血酶一起孵育时仅与序列中19个赖氨酸中的5个发生了生物素化反应。且基于TBA-凝血酶晶体结构，这些赖氨酸位于适体-蛋白质结合界面。定量显示K149、K109-110和K36分别被91%、74%和4%生物素化，证明了手柄转移适体的位点选择性（图2）。
图3. 核酸适体介导的凝血酶标记反应的选择性和时间梯度。
接下来，作者研究了共价适体的蛋白质靶标选择性，发现凝血酶(300 nM)在过量BSA(1.5 mM)的情况下仍能被完全生物素化。此外，为了评估这种方法在凝血酶的天然环境中的潜在用途，将凝血酶和TBA(3)-2在人血浆中孵育（总蛋白浓度为1.5 mM），在500 nM的适体浓度下实现了对凝血酶的高效的标记，且没有观察到其他蛋白质被生物素化。随后，时间梯度实验表明凝血酶的共价修饰不仅具有选择性，而且速度快，1 mM和0.5 mM的TBA(3)-2进行修饰的t1/2分别为9.6 min和34 min（图3）。作者更换了二乙氨基香豆素 (DE-ACM) 转移亲电试剂3，与TBA的T3偶联，进行了相似的实验，证明了不同基团递送的多功能性。
图4. 核酸适体与蛋白质的共价交联。
作者意识到可以通过“反转”弹头设计中的化学结构，将实现靶标蛋白质和适体之间的共价交联，而不是转移标记，这样可以保护交联适体免受核酸酶介导的降解。作者将如此设计的核酸适体以递增浓度与凝血酶共同孵育，并通过SDS-PAGE进行分析。正如预期的那样，适体与其目标发生交联，且每个蛋白质只与一个适体交联，选择性及交联位置依赖性与前述生物素标记反应相似。在确认适体与凝血酶的快速和选择性交联后，作者就试图确定共价连接的核酸适体是否会增强适体介导的凝血酶功能抑制，与未修饰的TBA相比，TBA(3)-4导致凝血时间延长2倍，表明可以通过共价交联增强适体的效力（图4）。
图5. 核酸适体介导的、将生物素、荧光团、同位素标记转移至目标蛋白上，实现目标蛋白的灵敏检测。
随后，作者尝试用该方法实现灵敏的凝血酶检测，作者将生物素化适体TBA(3)-2在凝血酶浓度降低的情况下孵育。通过蛋白质印迹法测量出的检测限为4 nM，使用荧光团转移适体TBA(3)-3的检测限为33 nM，含有γ-32P ATP的TBA(3)-4检测限降低到400 pM，证明共价适体提供了一个检测低丰度蛋白质的平台（图5）。与传统基于抗体的免疫印迹方法相比，这种方法更经济，因为寡核苷酸可以通过化学合成快速生成，批次间差异很小，并且保质期长。总之，本文开发了一种能够快速和选择性地进行蛋白质共价标记的适体，可将生物素和荧光团等功能基团转移到目的蛋白上，具有完全的蛋白质特异性和完全的赖氨酸化学选择性，可用于蛋白质的标记、功能调节及灵敏检测。https://doi.org/10.1002/anie.202101174原文引用：10.1002/anie.202101174
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