今天为大家推荐一篇发表在《Angew. Chem. Int. Ed.》上的“DNA tiling enables precise acylation-based labeling and control of mRNA”的文章，本文通讯作者是来自斯坦福大学跨学科生物科学研究所的Eric T. Kool教授。

对于研究mRNA生物学和未来的治疗方法，通常需要对长、天然RNA进行位点进行选择性标记。目前的方法包括工程化RNA序列，这可能改变RNA的折叠，或仅限于特定的序列或碱基。在这里，作者描述了一个通用的策略，通过一个新的DNA平铺方法接合mRNA。在该方法中TRAIL利用保护寡脱氧核苷酸池杂交和阻断mRNA，结合一个诱导剂DNA，挤出活性RNA环在预定位点酰化。使用TRAIL，一种叠氮酰基咪唑试剂用于标记和调控RNA，用于体外和细胞中的多种应用，包括RNA结合蛋白分析，细胞中mRNA成像，翻译分析和调控。TRAIL方法提供了一种有效和可实现的方法，可以标记和操作几乎任何长度或起源的RNA，而不改变固有序列。

图1.环诱导策略思路。该策略可以将反应定位于短RNA内的程序化位点。长RNA面临的挑战是如何在阻断RNA序列的同时在一个位点上诱导一个循环;这里作者考虑使用的补充保护DNA绑定RNA。mRNA和保护DNA的杂交能够产生带切口的复合物，并且已经证明在切口位置有大量堆积，作者假设这种在连接处的堆积可能足以阻止长RNA的反应性。通过这种方式，作者预计大部分mRNA可能在RNA/DNA双链结构中受到保护，使mRNA的2-OH高活性基团暴露在诱导剂DNA挤压的特定环位点上。在这种结构诱导之后，加入水溶性酰化剂(例如叠氮化物试剂)会影响共价偶联。对于分离，作者假设可以通过DNA酶一步消化去除DNA，并使用商业RNA清理柱纯化共轭RNA。

图2.首先确定DNA贴片对mRNA功能没有影响，作者选择了绿色荧光蛋白作为研究对象。比较了未处理mRNA (UT)与通过DNA贴片法(FC)从完全互补的DNA中纯化得到的mRNA的体外翻译效率。（a）结果表明：完全互补平铺杂交(FC mRNA)后mRNA的翻译效率与未处理的mRNA (UT)几乎相同。（b）接下来，作者研究了RNA中特定位点的诱导反应，方法是用一个诱导剂DNA替换一个保护DNA，以诱导一个位点定位环（见图1）。诱导剂的长度为30-60 nt，其设计目的是直接与邻近的保护剂的mRNA结合，但省略了mRNA中心位点的3-7个核苷酸，从而诱导一个RNA隆起环。结果表明：不同位点酰基化的mRNA表现出明显不同的翻译能力，5’ UTR-酰基化mRNA的表达量为阳性对照的~50%，而ORF-酰基化mRNA的表达量仅为~10%，提示核糖体被强烈阻断。另外作者对比的loop对于翻译的影响，结果发现：与3nt-loop情况相比，ORF中7nt-loop酰基化的mRNA表现出更有效的翻译抑制，可能是因为更多的酰基组。（c）为了进一步评价定位反应策略的选择性，作者通过定量PCR (RT- QPCR)和变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)分析逆转录酶(RT)引物延伸来检测酰基化mRNA。（d）选择性酰基化mRNA的RT-qPCR。在一个给定的环路中，mRNA的酰化程度达到~60-70%。（e）PAGE凝胶分析显示，RT引物在接近核苷酸分辨率的酰基化mRNA位点上延伸，导致cDNA的截断。（d）和（e）图都表明：mRNA的7nt-loop中出现了多个酰化，与短RNA的酰化模式一致。重要的是，数据还表明，在mRNA的某些位点的酰化可以强烈抑制翻译。这是第一次观察到2’-O-酰化阻滞了翻译。

图3.探索了在ORF区域的特定位点通过酰基化来控制翻译的可能性。（a）测试了单个ORF位点和联合酰基化位点的效果。（b）数据表明，在体外，在37℃条件下，加入3 mM水溶性磷化氢(TPPMS或THPP)孵育3h，酰基化mRNA的GFP表达被有效地抑制到非酰基化mRNA (FC)的5-15%，在单环病例中，逆转后可成功恢复到50-70%。2环组为40%-50%，3环组为30%-40%。

图4.在建立的局部酰化有效抑制翻译的条件后，作者继续测试ORF酰化mRNA是否能在不同的酰化位点诱导核糖体滞留。（a）作者通过局部酰化来阻止翻译，并通过抗嘌呤霉素抗体WB检测得到的截短片段。（b）作者检测到ORF5~ORF11的下游ORF酰化位点相关的停滞肽。有趣的是，并没有发现ORF1，ORF3并没有显示出明显的停滞肽，尽管显示出有效翻译抑制。（c）对于停滞位点，作者发现膦处理后，停滞肽消失。

图5.基于上述UTR位点酰化能够保留mRNA翻译能力，接下来，作者应用TRAIL进行UTR酰化和生物素化，并测试其识别相关细胞蛋白的能力。（a）作者通过TRAIL将生物素柄安装在5’UTR中，与生物素化试剂反应，并通过与已知mRNA相关蛋白进行pull-down实验（b）。（c）Western-blot结果显示，5’UTR生物素化的mRNA可以通过两种方式成功地下调PABP，而缺少生物素的azido-mRNA或未经处理的mRNA的对照显示没有蛋白带。

图6.转染到HeLa细胞中的Cy5标记mRNA转染到HeLa细胞中的成像和翻译(通过TRAIL标记)。（a）为了实现细胞三色成像，红色通道Cy5标记GFP mRNA,蓝色通道用于Hoechst 33342(细胞核)，绿色通道用于GFP(翻译效率)。将Cy5标记的mRNA转染到HeLa细胞中，可以看到与转染的mRNA相对应的亮红色斑点图像。（b）为了根据mRNA的标记位点来评估细胞内翻译效率，作者将Cy5标记在mRNA的不同位点。（c）作者观察到在UTR标记和poly(A) tail标记的mRNA中有效表达GFP (GFP/mRNA的荧光强度比为~2.2-4.8; GFP/Hoechst为~1.0-1.9)，而ORF标记的mRNA表达水平最低(GFP/mRNA比值为~0.6-1.0; GFP/Hoechst比值为~0.2-0.5)，如上结果所示，酰基化阻断了ORF的翻译。总的来说，这些结果证明了一种不阻止翻译的本地化荧光mRNA标记方法的成功。

图7.（a）作为通过TRAIL标记跟踪蛋白质-mRNA相互作用，作者监测了应激颗粒存在/不存在时Cy5标记的mRNA及其翻译水平。应激颗粒(Stress particles, SGs)是细胞质中相分离的无膜细胞器，由应激反应形成的mRNA和RNA结合蛋白组成，据文献记载，G3BP1蛋白可启动应激颗粒形成。（b）结果表明，在胁迫颗粒存在的情况下，无论标记位置如何，GFP的表达水平都显著降低，亚砷酸钠处理后，Cy5标记的mRNA(红色)与G3bp1标记的SGs(蓝色)共定位（c）这些观察结果与之前的报道一致，即部分细胞质mRNA在组装时定位于SGs，且SGs与翻译抑制相关。总的来说，TRAIL可以用于荧光标记一个mRNA，而不会对其翻译或与亚细胞间隔相关联产生强烈干扰。

在这里，作者报告了一个位点选择性酰化的mRNA的通用策略。TRAIL（平铺诱导环RNA酰化）：利用廉价互补DNA平铺和阻断mRNA用于长RNA(如mRNA)在几乎任何确定位置上的位点选择性修饰。作者发现，mRNA可以在不同区域(非翻译区(UTR)、poly(A) tail或开放阅读框(ORF))的选择性环位点上有效酰基化，并且描述了加合物对mRNA翻译的影响。研究发现，ORF区域内位点的精确酰化可以抑制mRNA的表达，并导致特定的核糖体停滞。如果需要，可以通过磷酸化处理有效地恢复已酰基化的mRNA活性，以恢复翻译能力。为了在不影响翻译的情况下进行标记，作者发现在UTR位点或poly(A)尾部的局部酰化保留了翻译能力，允许mRNA用荧光团或亲和柄进行标记。作者期望TRAIL方法能广泛应用于许多长RNA，以促进功能和相互作用的研究，并能被广泛应用于化学和生物实验室。

https://doi.org/10.1002/anie.202112106

Eric T. Kool教授在哥伦比亚大学获得化学博士学位，在加州理工学院做博士后。他于1990年来到罗切斯特大学，并在那里工作到1999年，此后他加入了斯坦福大学化学系。

Eric在该领域的诸多贡献有很多亮点。这些包括基于环状寡核苷酸的滚环扩增的发展，以及DNA碱基的非氢键结合等位基因可以正常作为DNA的一部分的想法，这表明聚合酶复制可以在没有Watson-Crick氢键的情况下发生。他继续使用修饰的DNA碱基来研究芳环堆积在DNA结构和热力学中的作用，并且还研发了新型的尺寸扩展的寡核苷酸xDNA，该寡核苷酸可增加可被DNA序列编码的信息，并有可能用于研究DNA的复制机制。

编辑：唐瑞

审核：韩娇娜

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