给大家分享一篇发表在Angew. Chem. 上的文章：“Thioester-Assisted Sortase-A-Mediated Ligation”，第一作者是 左冲 博士，通讯作者是中国科学技术大学生命科学学院 孙德猛 副研究员和清华大学 刘磊 教授。

通过连接精确设计的合成和重组片段将定制化修饰整合到蛋白质中，已被广泛用于生成携带位点特异性翻译后修饰(PTMs)或功能标签的蛋白质。在众多蛋白质修饰的连接策略中，sortase A（SrtA）介导的连接是一种常用的方法，因为SrtA容易获得，连接简单，反应稳定。SrtA介导的连接已被应用于多个领域。然而，经典的SrtA介导的连接有两个缺点：反应可逆、LPxTG motif依赖性。

为此，一些解决方案被提出，例如，使用缩肽类作为底物可以解决可逆性问题；此外，还发现了一些SrtA变体，可以识别LPxTG以外的序列。然而，一个能够同时克服反应可逆性和LPxTG依赖性的单一策略还没有被发现。

在此，作者发现：SrtA可以介导含有C端硫酯的蛋白质/肽与另一个含有N端Gly的蛋白质/肽的高效和不可逆的连接，并且可以兼容连接部位的各种LPxT衍生序列。这一发现大大扩展了典型的SrtA介导的连接范围。

此工作受到SrtA的机制研究的启发，研究表明存在一个关键的酰基-酶硫酯中间物。作者推测，带有C端硫酯的肽或蛋白质可能被SrtA直接识别。因此，首先合成了携带C端硫代乙酸甲酯（MTG）的六肽（YALPET）1，与等量的携带N端Gly的肽2（GLRDYPA）以及SrtA共孵育，几乎100%转化为连接产物3。

为了研究其他硫代酯类是否也能作为SrtA的底物，作者制备了硫代酯类1a-e。所有四个反应的转化率都比4或1e（只达到约50%）高（约80-100%）。

并测量了以1或4为底物的连接动力学参数，与经典肽4相比，SrtA对硫代酯1的亲和力稍低，但催化效率更高。

接下来，作者考察了该反应否能允许LPxTG motif的突变。合成了一系列包含LPxTG突变体的肽，所有的肽都带有C端MTG硫酯(Y-A-P4-P3-P2-P1-MTG)。实验表明，硫酯辅助的SrtA介导的连接可以兼容P1-P4位点的显著灵活性。且兼容P1-P4位点的一个以上的突变。

接下来研究了该方法是否能扩大蛋白质标记和半合成的范围和能力。选择了增强型绿色荧光蛋白（EGFP）来测试该方法的N端标记。带有N端Gly的EGFP 7与N端生物素修饰的MTG肽（LPET）硫酯6a，在SrtA存在的情况下，生成生物素修饰的EGFP，产率为90%。此外，还用更多携带其他功能标签（如荧光、叠氮和烷基）的MTG肽硫酯6b-6f处理7，产率达到70-86%。其次，使用泛素（Ub）来测试该策略的C端标记，同样产率可以达到70-92%。

该策略可以实现精确修饰的蛋白质半合成，并保留其完全的天然序列。利用该策略半合成了Ser139磷酸化组蛋白H2AX（H2AXS139ph）与Ley9二甲基化组蛋白H3（H3K9me2），分离率分别约为40%和60%。

在此基础上，作者使用硫酯辅助的SrtA介导的连接法合成了带有不同甲基化模式的H3（H3K9me、H3K9me2和H3K9me3），这三种蛋白与未甲基化重组H3 (H3K9me0)一起，通过与重组H2A、H2B、H4和半甲基化DNA的相互作用，重建组蛋白八聚体和核小体。由此产生的具有不同甲基化模式的四个核糖体被置于体外泛素化系统中，含有H3K9me2或H3K9me3的核糖体在1分钟内检测到泛素化的组蛋白条带，而含有H3K9me1或H3K9me0的核糖体则没有检测到。因此，H3K9me2和H3K9me3都能促进UHRF1在核糖体上的泛素化活性，而H3K9me1不能。

综上所述，SrtA可以介导含有C端硫酯的蛋白质/肽与另一个含有N端Gly的蛋白质/肽的高效和不可逆的连接，对各种LPxT衍生的序列具有广泛的兼容性。该策略能够快速制备带有各种N端或C端标签的蛋白质，包括翻译后修饰的蛋白质。验证了底物的化学修饰是增强现有酶法合成能力的一种有效手段。

原文链接：

https://doi.org/10.1002/anie.202201887