表面锚定了T细胞活化配体的人工抗原呈递细胞(Artificial antigen presenting cells, aAPCs)在过继免疫治疗中具有巨大的潜力。然而，通过传统的生物偶联化学来精确控制这些平台上的配体定位仍然是一个挑战。樊春海院士团队近日于Angew.Chem. 发表了题为“DNA-Edited Ligand Positioning on Red Blood Cellsto Enable Optimized T Cell Activation for Adoptive Immunotherapy”的文章，文中利用DNA辅助的自底向上的自组装，实现了精确调控T细胞活化配体在红细胞(Red blood cells, RBC)上的横向和纵向分布。

先简单介绍一下相关背景知识，工程T细胞活化平台，又称人工抗原呈递细胞（aAPCs），可代替天然抗原呈递细胞（APCs）刺激T细胞扩增，在T细胞活化机制的研究和在肿瘤的过继免疫治疗方面具有巨大的潜力。构建aAPCs一般通过集成T细胞受体(T cell receptor, TCR)配体如pMHC或CD3抗体，以及共刺激受体配体CD28抗体（aCD28）或4-1BBL抗体。

在现有的研究中已发现，pMHC在RBC上具有较短的垂直距离时更有利于T细胞活化，TCRs与pMHC之间的多价结合可能使TCR活化更有效，同时，T细胞配体的横向异质性分布可能影响T细胞的活化。因此配体的横向定位与纵向定位都会影响T细胞的活化。然而，在生物共轭化学中，很难调控活化配体在aAPCs上的三维定位，不能很好地模拟天然的APCs。而DNA技术是一个独特的工具，可以精确地设计细胞膜界面和调整细胞与细胞之间的相互作用。

图1

作者通过在红细胞表面组装不同序列的DNA来介导T细胞活化配体的精确组装。因为脂质结合的DNA可以自发高效插入活细胞膜，于是他们使用了两种不同序列的胆固醇功能化DNA(图1A)，而且证明了DNA可以快速插入到RBC膜中，且横向分布均匀(图1B)。然后，如图1A所示，将DNA1和DNA2插入RBC膜后，用生物素和atto 488修饰pMHC，然后通过生物素-亲和素相互作用将带有atto 488的pMHC组装到红细胞表面。之后作者验证了用pMHC和aCD28两种活化配体同时修饰RBC的必要性。结果发现红细胞表面同时修饰pMHC和 aCD28可以有效地诱导小鼠CD8⁺ T细胞的扩散，单独修饰pMHC或aCD28则活化能力有限(图1 F和1 G)。CFSE是一种标记细胞内蛋白质的染料，通过荧光标记的稀释来指示T细胞的分裂。此外，游离pMHC和aCD28效果也较差(图1F和1G)。另外由于CD4⁺ T细胞不能识别使用的pMHC，因此CD4⁺ T细胞经相同处理后几乎没有增殖(图1E和图1G)。

图2

接下来，他们通过DNA定向自底向上自组装实现pMHC和aCD28的横向异质性分布(图2A-2D)。使用共聚焦荧光成像显示，荧光标记的DNA1可以均匀地插入RBC膜，亲和素可以均匀地连接到红细胞上(图2E和2F)。之后pMHC组装到红细胞上，根据pMHC上atto488的数量，一个pMHC与4-5个生物素结合，每个亲和素上有4个生物素结合位点，多个生物素-亲和素相互作用将导致pMHC的横向异质性分布。成像结果显示，红细胞表面形成pMHC岛(图2G)，类似于天然APCs上的pMHC簇。

然后，用胆固醇修饰的DNA2和特异的cDNA2杂交介导aCD28的组装(图2C-D)。aCD28首先用alexa647修饰以与生物素修饰的cDNA2连接，再通过DNA特异性杂交连接到RBC表面。如图2H所示，aCD28在红细胞表面分布均匀。作者还探索了pMHC和aCD28的密度对T细胞增殖的影响，从而选择了pMHCs密度小于1216 /μm²和aCD28密度小于489 /μm²进一步激活T细胞研究。

紧接着，他们探究了细胞膜上T细胞活化配体的横向分布的影响。同时制备了配体分布均匀的红细胞和配体分布不均的红细胞。CFSE稀释实验显示，基于RBC配体分布不均的aAPCs能更有效地刺激CD8⁺ T细胞增殖。

图3

根据动力学分离模型，在抗原通过APCs呈递给T细胞的过程中，T细胞的膜会在TCR-pMHC相互作用区域形成突起。于是他们着手于调节pMHC与RBC膜之间的垂直距离优化aAPCs。由于短DNA双链的结构刚性，因此可以通过缩短DNA1的长度，缩短pMHC簇与红细胞膜的距离(图3A-B)，T细胞膜和红细胞膜之间的距离减少了约7.3 nm。随后，他们在CFSE稀释实验证实了当pMHC更靠近RBC膜时，T细胞的活化和增殖可以进一步增强 (图3H-I)。

在尝试将优化的aAPCs用于体内T细胞增殖和过继免疫治疗之前，作者首先在体外验证了优化后的aAPCs刺激OT-I小鼠T细胞靶向杀伤肿瘤细胞的效果。与之前的实验结果一致，与分布均匀的活化配体的aAPCs相比， pMHC聚集的aAPCs刺激的脾细胞中CD8⁺ T细胞的比例更高。此外，pMHC团簇靠近细胞膜的aAPCs刺激的脾细胞CD8+ T细胞比例更高。因此，优化后的aAPCs可以更有效地杀伤B16-OVA细胞（小鼠黑色素瘤，目标瘤细胞）。

图4

最后作者证明了优化的aAPCs可以刺激OT-I小鼠体内CD8⁺ T细胞的增殖(图4A)。他们从OT-I小鼠中获得脾细胞，并用CFSE染色。然后以2:1的比例将染色细胞与aAPCs混合，再注射到C57小鼠体内。6天后获得了C57小鼠脾细胞，并用流式细胞术检测抗原特异性CD8⁺ T细胞的增殖。发现与未注射aAPCs组相比，抗原特异性CD8⁺ T细胞在注射aAPCs组中明显增殖 (图4B-C)。此外，作者还在小鼠体内应用优化的aAPCs对B16OVA肿瘤进行过继免疫治疗。如图4D所示，在肿瘤植入后第7天，静脉注射OT-1小鼠脾细胞(2×10⁷/只)和优化的aAPCs(1×10⁷/只)。对小鼠进行三种不同处理，密切监测肿瘤生长和小鼠存活率。与与未处理小鼠和只注射OT-I小鼠脾细胞或只注射aAPCs的小鼠相比，同时注射OT-I小鼠脾细胞和aAPCs的小鼠显示出最有效的抑制肿瘤生长效果以及大大延长了生存时间(图4E-F)。

总结：本文充分利用了细胞膜的流动性，开创性地使用DNA技术精确地调控了活化配体在细胞膜上的横向异质性分布和纵向异质性分布。综上，基于RBC的优化的aAPCs更好地模拟了天然APCs，有望在过继免疫治疗中取得更好的效果。

【文章链接】

https://onlinelibrary.wiley.com/doi/abs/10.1002/anie.202003367

【DOI号】

10.1002/anie.202003367

【本文作者】

曹祯媛

黄硕课题组2020级硕士研究生